miRNA-124-3p抑制劑通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)缺氧缺糖心肌細(xì)胞凋亡的研究*

馬彥娟，任 芳，李 闖，陳希妍，楊 平，石金河

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診科，河南衛(wèi)輝 453100)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是一種嚴(yán)重的心臟疾病，是由于急性冠狀動(dòng)脈閉塞后導(dǎo)致的缺血缺氧而引起的心肌細(xì)胞死亡[1]。目前，大量研究表明在AMI心肌細(xì)胞功能受損和心力衰竭中，炎癥和心肌細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要作用[2]。miRNA是一類非編碼的長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸的短鏈RNA，其在細(xì)胞的多種功能調(diào)節(jié)，如分化、增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等中發(fā)揮著重要作用[3]。研究顯示miRNA-124在AMI患者血清中的表達(dá)升高[4]，下調(diào)miRNA-124-3p可通過抑制心肌細(xì)胞凋亡而發(fā)揮對(duì)心肌梗死的保護(hù)作用[5]。還有研究表明，Wnt信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)大鼠心肌梗死模型中的細(xì)胞凋亡[6]。miRNA-124-3p是否可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮心肌細(xì)胞凋亡保護(hù)作用的研究還未見報(bào)道。本研究以H9C2細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation，OGD)模型中miRNA-124-3p抑制劑在調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路中及細(xì)胞凋亡的可能作用，為心肌細(xì)胞缺血缺氧的治療提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

高糖DMEM培養(yǎng)基、低糖DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；Wnt1 siRNA、陰性對(duì)照(negative control，NC)siRNA(美國(guó)SANTA Cruz公司)；miRNA-124-3p抑制劑(上海吉瑪基因公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；Wnt1抗體、β-catenin抗體、p53抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體(美國(guó)SANTA Cruz公司)；裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved-caspase-3)抗體(美國(guó)Abcam公司)；GAPDH抗體(美國(guó)Sigma公司)；熒光Ⅱ抗(美國(guó)LI-COR公司)。

1.2 方法

1.2.1H9C2的培養(yǎng)

大鼠心肌細(xì)胞H9C2細(xì)胞株(協(xié)和細(xì)胞庫)培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)基(內(nèi)含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素及0.1 mg /mL鏈霉素)，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱，2～3 d傳代1次。

1.2.2OGD模型的建立及實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組

正常條件下培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞，更換成無血清低糖DMEM培養(yǎng)基，1% O2、94% N2、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，形成OGD模型。細(xì)胞分為正常對(duì)照組、OGD組、NC-siRNA組(轉(zhuǎn)染NC-siRNA后OGD條件培養(yǎng)48 h)、miRNA-124-3p抑制劑組(轉(zhuǎn)染miRNA-124-3p抑制劑后OGD條件培養(yǎng)48 h)和Wnt1 siRNA組(轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt-1 siRNA后OGD條件培養(yǎng)48 h)。

1.2.3心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染

利用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑分別將miRNA-124-3p抑制劑、Wnt1 siRNA與NC-siRNA轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞。

1.2.4心肌細(xì)胞活性的檢測(cè)

將H9C2接種于無菌的96孔板中，密度為5×103個(gè)/孔，按照1.2.2方法將細(xì)胞分為5組，在OGD培養(yǎng)48 h后檢測(cè)各組細(xì)胞活性，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育3 h，酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)光密度(A)值。

1.2.5Western blot

利用RIPA裂解液提取5組細(xì)胞總蛋白。常規(guī)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳及轉(zhuǎn)膜后，室溫條件下封閉膜1 h(利用5%脫脂奶粉)，分別用Wnt1抗體(1∶1 000)、β-catenin抗體(1∶1 000)、p53 抗體(1∶500)、Bax抗體(1∶500)、Bcl-2抗體(1∶500)、cleaved-caspase-3抗體(1∶1 000)及GAPDH抗體(1∶10 000)4 ℃條件下孵育膜過夜(12 h以上)，室溫避光條件下熒光Ⅱ抗(1∶1 000)孵育2 h，利用Odyssey曝光，Image J軟件分析灰度值。

1.2.6ELISA檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-6及IL-1β的水平

收集上述5組細(xì)胞的培養(yǎng)液，2 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液，采用ELISA法測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6及IL-1β水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 miRNA-124-3p抑制劑與Wnt1 siRNA對(duì)Wnt1及β-catenin表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與NC-siRNA組比較，miRNA-124-3p抑制劑組和Wnt1 siRNA組心肌細(xì)胞Wnt1及β-catenin表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，而NC-siRNA組與OGD組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1、2。

1：正常對(duì)照組；2：NC-siRNA組；3：Wnt1 siRNA組；a：P<0.01，與NC-siRNA組比較。

1：正常對(duì)照組；2：NC-siRNA組；3：miRNA-124-3p抑制劑組；a:P<0.05，與NC-siRNA組比較。

2.2 各組心肌細(xì)胞活性比較

CCK-8結(jié)果顯示，正常對(duì)照組心肌細(xì)胞的活性較高，而OGD組心肌細(xì)胞的活性明顯降低(P<0.05)；與OGD組比較，miRNA-124-3p抑制劑組和Wnt1 siRNA組細(xì)胞活性明顯升高(P<0.05)，而miRNA-124-3p抑制劑組和Wnt1 siRNA組細(xì)胞活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

2.3 各組p53、Bcl-2、Bax及cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平比較

與正常對(duì)照組比較，OGD組p53、Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，而Bax及cleaved-caspase-3的表達(dá)水平升高(P<0.05)。與OGD組比較，miRNA-124-3p抑制劑組和Wnt1 siRNA組p53、Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，Bax及cleaved-caspase-3表達(dá)水平降低(P<0.05)，而miRNA-124-3p抑制劑組和Wnt1 siRNA組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

2.4 各組TNF-α、IL-6及IL-1β水平比較

與正常對(duì)照組比較，OGD組TNF-α、IL-6及IL-1β水平升高(P<0.05)；與OGD組比較，miRNA-124-3p抑制劑組和Wnt1 siRNA組TNF-α、IL-6及IL-1β水平明顯降低(P<0.05)，而miRNA-124-3p抑制劑組和Wnt1 siRNA組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

1：正常對(duì)照組；2：OGD組；3：NC-siRNA組；4：miRNA-124-3p抑制劑組；5.Wnt1 siRNA組；a：P<0.05。

表1 各組TNF-α、IL-6及IL-1β水平比較

3 討 論

AMI是當(dāng)前臨床上常見的缺血性心臟病之一，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，研究表明炎癥和心肌細(xì)胞凋亡參與介導(dǎo)心肌功能受損和心力衰竭，在AMI的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[2,7]。

Wnt通路是一種進(jìn)化保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在個(gè)體發(fā)育和成人期調(diào)控著多種細(xì)胞功能。AMI發(fā)生后，Wnt信號(hào)通路通常會(huì)被激活，因此，通過抑制Wnt信號(hào)通路的激活或可成為一種減輕或修復(fù)AMI所引起的心肌細(xì)胞損傷的有效策略[8-9]。

MiRNA是一類非編碼短鏈RNA，多種miRNA在心肌細(xì)胞的損傷中及AMI的治療中發(fā)揮著重要作用[10-11]。MAYORGA等[12]研究表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路及miRNA-145參與AMI發(fā)展的調(diào)節(jié)。SUN等[6]研究顯示miRNA-154通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞的凋亡。miRNA-34a通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，調(diào)控AMI所引起的細(xì)胞凋亡[13]。作為miRNA家族的成員之一，miRNA-124-3p也在細(xì)胞的增殖與凋亡中發(fā)揮著作用[14-15]。BAI等[16]研究顯示，CircHIPK3與miRNA-124-3p 結(jié)合可抑制心肌缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞增殖能力和誘導(dǎo)凋亡，下調(diào)miRNA-124-3p可通過抑制心肌細(xì)胞凋亡而發(fā)揮對(duì)心肌梗死的保護(hù)作用[5]。然而，miRNA-124-3p的作用機(jī)制并不明確，在OGD條件下，抑制miRNA-124-3p與Wnt/β-catenin信號(hào)通路及細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，還未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利用OGD模型轉(zhuǎn)染miRNA-124-3p抑制劑與Wnt1 siRNA至心肌細(xì)胞后，Wnt1 siRNA可有效敲低模型心肌細(xì)胞Wnt1與β-catenin的表達(dá)，而miRNA-124-3p抑制劑同樣可有效敲低模型心肌細(xì)胞中Wnt1與β-catenin的表達(dá)，說明miRNA-124-3p對(duì)其有一定的調(diào)節(jié)作用；與OGD組細(xì)胞相比較 miRNA-124-3p抑制劑與Wnt1 siRNA可提高OGD組中心肌細(xì)胞的活性，且二者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

為了檢測(cè)miRNA-124-3p抑制劑與Wnt1 siRNA在心肌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制，本課題組利用Western blot 檢測(cè)了各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，與正常對(duì)照組相比較，OGD組細(xì)胞中p53、Bcl-2蛋白的表達(dá)均明顯降低，Bax及cleaved-caspase-3的表達(dá)明顯升高；而與OGD組比較，miRNA-124-3p抑制劑組和Wnt-1 siRNA組細(xì)胞中p53、Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯升高，Bax及cleaved-caspase-3的表達(dá)明顯降低，且兩組p53、Bcl-2、Bax及cleaved-caspase-3蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，ELISA結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miRNA-124-3p抑制劑及Wnt1 siRNA后，細(xì)胞中TNF-α、IL-6及IL-1β水平均明顯降低，且二者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明miRNA-124-3p抑制劑對(duì)OGD的心肌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，miRNA-124-3p抑制劑可通過抑制Wnt1與β-catenin的表達(dá)來抑制Wnt信號(hào)通路的激活，進(jìn)一步抑制心肌細(xì)胞的凋亡，減輕細(xì)胞損傷，減少炎性因子的釋放，對(duì)OGD的心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用?？蔀榕R床心肌細(xì)胞缺血缺氧的治療提供參考。