血清miR-223及miR-155對新生兒肺炎的診斷價值研究*

馮 瓊，林 虹，蔡興俊

(海南省人民醫院新生兒科，海口 570311)

新生兒肺炎是新生兒常見病，可于宮內、分娩過程中或出生后發病，主要由不同病原體(如細菌、病毒、支原體、真菌等)感染引起，其是引起新生兒死亡的主要原因，有報道圍生期新生兒肺炎病死率達10%～20%[1]，對新生兒生存質量、生長發育造成嚴重影響。因此，早期診斷新生兒肺炎、及時采取相應積極措施進行干預是提高新生兒存活率及生存質量的關鍵。臨床上通常經驗性使用廣譜抗生素對新生兒肺炎進行治療，以至于不規范使用抗菌藥物導致患兒產生大量耐藥菌株，對后續治療效果帶來嚴重影響[2-3]。新生兒肺炎早期臨床表現不明顯，病原學檢查往往比較滯后，缺乏快速、靈敏、特異的診斷指標[4]。以往研究常以白細胞計數、白細胞介素-6(IL-6)等評價機體炎性反應程度，但此類指標靈敏度、特異度較低[5]。因此，尋求有效、準確的生物學指標對診斷新生兒肺炎意義重大。微小RNA(miRNA/miR)是一類高度保守、內源性、非編碼核苷酸，與機體免疫功能異常存在密切關系[6]。邵慧芝等[7]研究發現，與健康兒童比較，重癥肺炎患兒外周血miR-223水平明顯升高，可作為重癥肺炎早期診斷標志物之一。張薇等[8]研究發現，與健康對照組比較，支原體肺炎患兒外周血miR-155表達水平明顯升高，推測miR-155參與支原體肺炎的發生、發展。然而，有關miR-223、miR-155在新生兒肺炎中表達情況的研究卻鮮有報道，故本研究同時探討生兒肺炎患兒血清miR-223、miR-155表達情況，以期為診斷新生兒肺炎提供一定參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年9月至2017年9月本院新生兒科收治的121例新生兒肺炎患兒作為新生兒肺炎組。納入標準：(1)符合臨床新生兒肺炎診斷標準[9]；(2)足月產；(3)臨床資料完整。排除標準：(1)伴有其他感染性疾病；(2)一般情況較差；(3)臨床資料不完整。另選取同期于本院正常分娩的120例健康新生兒作為對照組。所有新生兒均為單胎。本研究經本院醫學倫理委員會批準，所有標本采集均取得患者及家屬知情同意并簽字。

1.2 方法

1.2.1主要試劑與儀器

TRIzol試劑(貨號MN562J2)、逆轉錄試劑盒(貨號J6547M)、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(貨號N5643MJ)購自美國Sigma公司、SYBR Premix ExTaq試劑盒(貨號N5643MJ)PrimeScript RT reagent試劑盒(貨號ND6527J)、IL-6 ELISA試劑盒(貨號726-NDY)均購自北京中衫金橋公司；實時熒光定量PCR分析儀(型號7500)、分光光度計(型號UV-3672)購自美國Sigma公司；全自動熒光免疫分析儀(型號VI-DAS30)購自法國梅里埃公司；全自動酶標儀(型號COBAS 601)購自德國羅氏公司。

1.2.2標本采集及保存

根據所有患兒病原學檢測結果及病情，對其進行相應抗菌治療，分別于治療前、后抽取靜脈血3 mL。對照組采集臍帶血3 mL，離心10 min(2 000 r/min)，分離得血清，于-80 ℃冰箱內保存，待測。

1.2.3觀察指標

采用全自動熒光免疫分析儀及配套試劑測定受試者治療前、后血清中降鈣素原(PCT)水平，采用全自動酶標儀測定血清中IL-6水平，以上操作嚴格按照儀器、試劑及試劑盒說明書進行。觀察治療前、后水平變化。

1.2.4qRT-PCR檢測血清miR-223、miR-155相對表達水平

采用Trizol試劑提取兩組新生兒治療前、后血清總RNA，按照試劑盒說明書進行操作，使用分光光度計測定RNA濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。以RNA為模板，按照PrimeScript RT reagent試劑盒說明書進行逆轉錄反應，以cDNA為模板，參照SYBR Premix ExTaq試劑盒進行qRT-PCR反應。反應體系20.0 μL：2×UltraSYBR mixture 10.0 μL，cDNA模板(25 ng/μL)2.0 μL，上下游引物各2.0 μL，ddH2O 4.0 μL。反應條件：預變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 20 s，共40個循環。引物由大連寶生生物工程有限公司設計并合成，miR-223、miR-155均以U6作為內參基因。采用2-ΔΔCt方法計算兩組新生兒血清中miR-223、miR-155相對表達水平。引物設計見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組一般資料

兩組性別、胎齡、年齡、出生方式比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組一般資料比較

2.2 兩組miR-223、miR-155、PCT、IL-6相對表達水平比較

與對照組比較，新生兒肺炎組治療前miR-223、miR-155、PCT及IL-6水平明顯升高(P<0.05)；兩組治療后miR-223、miR-155、PCT及IL-6水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。與治療前比較，新生兒肺炎組治療后miR-223、miR-155、PCT及IL-6水平明顯降低(P<0.05)，見表3。

表3 兩組miR-223、miR-155、PCT、IL-6相對表達水平比較

2.3 兩組miR-223、miR-155及PCT、IL-6相關性分析

Pearson相關性分析顯示，兩組miR-223與miR-155、PCT、IL-6表達呈正相關(P<0.05)，miR-155與miR-223、PCT、IL-6表達亦呈正相關(P<0.05)，見表4。

表4 兩組miR-223、miR-155及PCT、IL-6相關性分析

2.4 miR-223、miR-155、PCT、IL-6對新生兒肺炎診斷的ROC曲線

以血清miR-223、miR-155、PCT、IL-6水平為檢驗變量繪制ROC曲線，結果顯示血清miR-223、miR-155、PCT、IL-6水平診斷新生兒肺炎的AUC分別為0.886(0.833，0.939)、0.825(0.750，0.901)、0.812(0.737，0.891)、0.831(0.839，0.903)，截斷值分別11.36、4.32和8.13 ng/mL、35.69 pg/mL，靈敏度分別為85.9%、81.5%、82.7%、83.6%，特異度分別為82.7%、78.7%、77.3%、82.1%；四者聯合診斷的AUC為0.956(0.961，0.953)，靈敏度為96.2%，特異度為93.8%，見圖1。

圖1 miR-223、miR-155、PCT、IL-6對新生兒肺炎診斷的ROC曲線

3 討 論

新生兒肺炎是新生兒時期常見病、多發病，臨床表現往往不典型，常與其他疾病并發，漏診、誤診率較高，且由于新生兒特殊的生理、免疫狀態，使得病情變化較快，極易出現窒息、呼吸衰竭，嚴重者出現循環衰竭甚至死亡[10]。因此，預防新生兒肺炎的發生，及早做出準確診斷并采取積極措施進行干預是研究的熱點。

成熟miRNA是長度為20～23個核苷酸的單鏈RNA分子，是基因表達的重要調節劑，通常會降低mRNA穩定性。miRNA靶向主要是通過miRNA 5′端(“種子”區域)與mRNA編碼區和非翻譯區(UTR)內的位點之間的特定堿基配對相互作用實現的。其在調節生物學過程(如免疫細胞譜系的發生、分化和成熟及維持免疫穩態、正常功能)中起著重要作用[11]。但有研究報道，miRNA家族中miR-223[12]、miR-155[13]在肺炎繼發膿毒癥患者中、支原體感染肺炎模型小鼠中有較高的臨床診斷價值。因此推測miR-223、miR-155異常表達與新生兒肺炎發生有關，且有一定的診斷價值。本研究探討新生兒肺炎患兒血清miR-223、miR-155表達情況，以期為尋找準確、有效的新生兒肺炎早期診斷指標提供一定參考。顏保松等[14]研究發現，肺結核組患者外周血中miR-223水平明顯高于健康對照組，且對肺結核具有較高診斷價值。本研究結果顯示，新生兒肺炎組患兒治療前血清中miR-223水平明顯高于對照組，治療后血清miR-223恢復至正常水平，提示miR-223可能與新生兒肺炎發生、發展關系密切。周好好等[15]研究發現，與正常對照組比較，哮喘模型組小鼠肺組織中miR-155水平明顯升高，推測miR-155可能參與了哮喘發病過程。本研究顯示，新生兒肺炎組患兒治療前血清中miR-155水平明顯高于對照組，治療后血清中miR-155水平同樣恢復至正常水平，提示miR-155可能參與了新生兒肺炎發病過程。

以往有學者以PCT、IL-6等感染性標志物在新生兒肺炎患兒中的表達情況對病情做出診斷[16]。但有研究顯示，PCT、IL-6等在新生兒肺炎患兒血清中高表達，與新生兒肺炎發生、發展關系密切，但IL-6靈敏度、特異度較低[17]。本研究結果顯示，與對照組比較，新生兒肺炎組患兒治療前血清中PCT、IL-6水平明顯升高，治療后，血清中PCT、IL-6水平恢復正常水平；與治療前比較，新生兒肺炎組患兒治療后血清中PCT、IL-6水平明顯降低，與以往研究趨勢一致，這提示PCT、IL-6與新生兒肺炎發生、發展關系密切。正常情況下，血液循環中PCT、IL-6水平較低，炎性反應中PCT、IL-6水平升高。研究顯示，PCT、IL-6水平與病情嚴重程度相關，可以反映炎癥損傷的嚴重程度[18]。本研究進一步發現，血清miR-223與miR-155、PCT、IL-6表達呈正相關，miR-155與血清miR-223、PCT、IL-6表達呈正相關。提示血清miR-223、miR-155與PCT、IL-6一樣具有早期評估新生兒肺炎的能力。

綜上所述，miR-223、miR-155異常高表達可能與新生兒肺炎發生、發展有關，具有評估新生兒肺炎的能力，且miR-223、miR-155、PCT及IL-6聯合檢測明顯提高了對新生兒肺炎的診斷靈敏度及特異度，可為臨床對新生兒肺炎的診斷提供一定參考。然而本研究并未對miR-223、miR-155、PCT及IL-6在新生兒肺炎患兒中的具體作用機制進行闡述，因此，后期應進行大樣本量的研究并對具體機制進行探討。