小鼠淋巴細胞內多肽的分離鑒定

郭婷婷，欒媛媛，范夢珠，王娟，肖珊珊，陳承余，張少輝,

（1.上海交通大學農業與生物學院，上海200240；2.浙江輝肽生命健康科技有限公司,浙江溫州325800）

0 引言

近年來，生物活性肽已經成為人們耳熟能詳的一個詞語。因其具有很多潛在的生物功能，所以引起人們越來越多的關注，成為科學研究的熱點之一[1]。目前很多生物活性肽的有益效果也已經得到了很好的證明，如抗癌[2]、降血壓[3-4]、抗菌[5]、降膽固醇[6]、抗糖尿病[7]等等特性。當前最權威的生物活性肽數據庫BIOPEP-UMW中已報告了3 000多個不同的生物活性肽。

目前對于生物活性肽的研究多集中于食物衍生多肽，對非食物衍生多肽研究和報道較少。且已經有研究結果證實，與食物衍生的生物活性肽相比，非食物衍生的生物活性肽具有更高的親和力并能有效發揮其生物活性功能[8]。淋巴細胞是免疫系統的中央調節細胞，其大部分功能是由一組被稱為淋巴因子的小分子多肽介導的。這些小分子多肽的表達和分泌均是由于抗原刺激的細胞激活而誘導[9]。所以淋巴細胞是動物機體內產生免疫調節肽的主要來源。

本文以小鼠脾淋巴細胞為研究對象，從淋巴細胞中分離和鑒定多肽組分，并建立一個“小鼠淋巴細胞多肽數據庫”，為后續淋巴細胞的多肽組學研究提供參考，為開發具有免疫調節功能的生物活性肽產品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：Balb/c小鼠（SPF級，雄性8周齡），上海捷斯捷實驗動物公司；10k超濾管，賽多利斯(上海)貿易有限公司；尼龍網(100目、200目），深圳達科為生物技術有限公司；35 mm細胞培養皿，美國Corning公司；6孔細胞培養板，美國Corning公司；血球計數板，上海康德萊股份有限公司；C18多肽脫鹽柱，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

試劑：小鼠淋巴細胞分離液，深圳達科為生物技術有限公司；RPMI-1640完全培養液，江蘇凱基生物科技有限公司；RPMI-1640不完全培養液，江蘇凱基生物科技有限公司；臺盼藍染色試劑盒，江蘇凱基生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS），碧云天生物技術研究所；Hank’s溶液，碧云天生物技術研究所；小鼠抗體(CD3-FITC、CD19-PE)，美國BD公司；脂多糖（LPS），西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；二硫蘇糖醇（DTT），西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；碘乙酰胺（IAA），西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；乙腈，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；甲酸，上海安普實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

BJ-2CD超凈工作臺，上海屹明凈化設備有限公司；離心機，中國上海醫療器械股份有限公司；GI36T高壓滅菌鍋，廈門致微儀器科技有限公司；Froma 700低溫冰箱，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；BD FACS Calibur流式細胞儀，美國BD公司；超聲波破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；細胞培養箱，德國MEMMERT公司；離心濃縮干燥儀，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；納升液相-Q Exactive四極桿超高分辨軌道阱質譜儀(Nano LC-Q Exactive Plus)，美國Thermofisher公司；三孔電熱恒溫水浴鍋，上海一恒儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠飼養

從上海交通大學動物實驗中心訂購實驗小鼠，在SPF級動物房內適應性飼喂一周。小鼠飼養條件為：溫度18～22℃，相對濕度50%～80%，每日光照和黑暗環境各12 h。每只鼠籠內小鼠數量不得多于3只，喂養期間應及時更換墊料，并保證水和飼料的供給充足。適應性飼養結束后，實驗小鼠各項體征指標良好，適宜開展后續實驗。

1.3.2 小鼠脾臟組織單細胞懸液的制備

按照國家《實驗動物管理條例》有關要求對實驗小鼠實施斷頸處死，置于75%酒精中浸泡5 min，隨后轉移至超凈工作臺內。將老鼠四肢用大頭計固定在泡沫板上，使小鼠腹部朝上，用消毒后的鑷子輕輕夾起小鼠腹部皮毛，用手術剪小心剪開使其內臟暴露，挑出脾臟。用PBS緩沖溶液洗滌脾臟后用已消毒的眼科剪將脾臟剪碎，置于35 mm培養皿中，加入5 mL小鼠淋巴細胞分離液，用注射器活塞研磨（研磨操作如圖1）。用巴斯德吸管吸取組織研磨液，過100目尼龍網，1 500 rpm，離心3 min，再用Hank’s溶液清洗3次，500 rpm短時低速離心，以200目細胞篩過濾，制得脾臟組織單細胞懸液備用。

圖1 脾臟研磨方法

1.3.3 小鼠淋巴細胞的提取與培養

在離心管中加入6 mL淋巴細胞提取液（取用前恢復至室溫并搖勻），再沿管壁緩慢加入5 mL脾臟組織單細胞懸液，覆蓋400μL的RPMI 1640完全培養液，室溫條件下，2 000 rpm離心30 min。離心后可見明顯分層（如圖2）。棄上層細胞培養液，吸出中間白色淋巴細胞層，加入10 mL RPMI 1640完全培養基，顛倒洗滌細胞，使其充分混勻，室溫條件下，700 rpm離心10 min，傾倒上清，重復洗滌3次后，用5 mL RPMI 1640不完全培養液重懸細胞，并計數細胞。取10μL細胞懸液，以臺盼藍染色確定細胞存活率，存活率大于90%說明細胞培養成功，可進行下一步實驗。

圖2 細胞分層示意

調整細胞濃度為1×106cells/mL接種于6孔板中，每孔板加入2 mL細胞懸液，在37℃、95%、5% CO2條件下培養6 h，培養期間每隔2 h微微晃動6孔板，使細胞均勻分布懸浮于培養液中。

1.3.4 流式檢測細胞純度

收集6孔板中的細胞于15 mL離心管中，棄去舊培養基，加入5 mL PBS洗滌細胞，室溫、1 000 rpm離心5 min，棄上清液，加入5 mL RPMI 1640完全培養液重懸細胞，用無菌吸管反復吹散細胞，制備成單細胞懸液，并用血球計數板計數。

取2 mL單細胞懸液于15 mL離心管內，室溫、1 000 rpm離心5 min，棄上清，加入適量體積的PBS緩沖液調整細胞密度為1×106cells/mL，吹打混勻細胞，1 000 rpm離心5 min，棄上清后洗滌2次，加入適量PBS緩沖液重懸細胞。分別吸取100μL細胞懸液于4個5 mL流式染色管中（實驗管和空白對照管）。按照抗體說明書和表1向流式染色管中加入適量熒光標記的小鼠抗體CD3-FITC和CD19-PE，室溫避光孵育20 min，用流式細胞儀檢測。

表1 流式染色管布局

1.3.5 炎癥細胞的構建

完成流式檢測后回收細胞，培養48 h，更換新鮮培養液，在實驗組細胞中加入質量濃度為10μg/mL的LPS溶液，對照組加等量的PBS溶液，最終濃度為500 ng/mL。繼續培養8 h后于低倍鏡下觀察細胞生長狀態趨于穩定，計數并收集細胞。

1.3.6 淋巴細胞內多肽的獲取

將收集的細胞用PBS溶液洗滌，室溫、4 000 rpm離心5 min，離心后棄上清，重復兩次。加PBS重懸細胞沉淀，超聲破碎，破碎時間50 min，超聲時間5 s，間隔5 s。將破碎后的混合液加入2.5倍體積的100%乙腈，振蕩15～30 min，4℃、12 000 rpm離心20 min，取上清，用離心濃縮儀干燥。干燥的沉淀用50 mmol/L NH4HCO3重溶后，加入1 mol/L二硫蘇糖醇溶液（DTT），在60℃水浴鍋溫育60 min。再加1 mol/L的碘乙酰胺溶液(IAA)，室溫避光反應40 min。將上述溶液12 000 rpm離心10 min，取上清加至10 ku超濾管，12 000 rpm離 心40 min，再 加 入50μL 50 mmol/L NH4HCO3，12 000 rpm離心20 min，收集濾液。濾液用離心濃縮儀進行干燥，干燥后的樣品取一半用C18脫鹽柱脫鹽處理，上機測試。

1.3.7 淋巴細胞內多肽的分析

使用納升液相-Q Exactive四極桿超高分辨軌道阱質譜儀(Nano LC-Q Exactive Plus)分析淋巴細胞內多肽。分析柱為C18反相分析柱(75μm×50 cm，1.9μm)；流動相A為99.9%水和0.1%甲酸混合液，流動相B為80%乙腈和0.1%甲酸混合液。液相梯度為：0～1 min，2%～6% B；1～38 min，6%～22% B；38～46 min，22%～32% B；46～48 min，32%～100% B；48～60 min，100% B。流動相流速為300 nL/min。ESI+模式，采用數據依賴性掃描模式，在分辨率為70 000(AGC 3e6)的軌道阱中進行全掃描采集(m/z 350～1800)。將分離出的前20個肽信號(電荷態≥+2)母離子通過高能碰撞(HCD)破碎，標準化碰撞能（NCE）為28.0。毛細管的溫度是275℃，噴霧電壓是1 800 V。子離子在分辨率為17 500(AGC 1e5)的軌道上測量。全掃描和MS-MS掃描的最大填充時間分別設置為50 ms和45 ms，動態排除時間設置為30 s。

1.3.8 數據處理

利用PEAKS X軟件對樣品進行搜庫分析。小鼠蛋白數據庫下載自UniProt網站（16992條）。分析參數為：母離子質量容差：1×10-5，二級譜圖質量容差：0.020 u，固定修飾為Carbamidomethyl（C），可變修飾為Deamidation（NQ），Oxidation(M)，非酶切方式。通過搜庫分析，得到樣品中多肽及蛋白定性信息。

2 結果分析與討論

2.1 流式檢測細胞純度

從小鼠脾臟提取淋巴細胞后，計數細胞并用流式細胞儀檢測淋巴細胞的純度。結果顯示CD3和CD19陽性，小鼠淋巴細胞數量6×106cells/只，純度達到98.3%（見圖3），一般認為當細胞純度達到95%及以上，該細胞純度較好，因此從小鼠脾臟中提取的淋巴細胞滿足下一步實驗要求，適宜開展胞內多肽分析實驗。

圖3 流式檢測小鼠脾淋巴細胞純度

2.2 納升液相-Q Exactive四極桿超高分辨軌道阱質譜儀分析結果

從UniProt網站下載小鼠蛋白數據庫，該數據庫共包含16882條鼠源多肽的詳細數據，也是目前數量最多、信息最全的蛋白數據庫，故選此數據庫作為本研究的多肽檢索數據庫。通過Nano LC-Q Exactive Plus(納升液相-Q Exactive四極桿超高分辨軌道阱質譜儀)鑒定多肽，使用PEAKS X軟件對樣品進行搜庫分析，質譜結果如圖4所示。同時結合使用Target-decoy過濾方法，在給定錯誤發現率（FDR=1%）下篩去部分假陽性結果的多肽序列，鑒定出多肽的數量。在確定多肽的母體蛋白時，要求肽段覆蓋率達到50%以上，且分數達到40分以上可認為該蛋白來源具有較高可信度。對質譜結果進行數據分析和統計表明，本研究從小鼠脾淋巴細胞中共鑒定得到385條多肽，其中實驗組鑒定得到多肽309條，來源于116條前體蛋白；對照組鑒定得到多肽149條，來源于51條前體蛋白（見圖5）。且有73條多肽在實驗組和對照組中同時存在。以上結果說明小鼠脾淋巴細胞在在受到外源性不良刺激后胞內的多肽種類和數量發生了非常大的變化。

多肽的來源可以分為外源性多肽和內源性多肽兩大類，目前多肽的研究主要集中于外源性多肽，一般直接或間接來源于動植物蛋白質。比如Dallas和Pisanu等人通過NANO-LC-QTOF法對牛乳和羊乳進行肽譜分析，分別鑒定出159和187種肽[10-11]。Zhang等人在通過凝膠過濾色譜法和反相HPLC純化后，在酶促大豆水解物檢測到104種肽[12]。內源性多肽主要來源于活體生物器官、組織、細胞和體液等等。之前有研究通過超濾分離糖尿病患者尿液中的天然肽，并通過LC-MS/MS進行分析。在UniProt人類蛋白質數據庫中搜索MS/MS數據以進行肽和蛋白質鑒定，共鑒定出1080種肽，對應于總共100種蛋白質[13]。還有研究人員對3種不同的人細胞系（SH-SY5Y、MCF7和HEK293）進行了多肽組學分析，鑒定發現272條多肽，并且部分多肽同時存在于不同細胞系中[14]。所以，從生物體自身組織和細胞中可以獲得大量的多肽組分，本研究結果與這些報道基本一致。

圖4 淋巴細胞受到LPS刺激前后胞內多肽質譜圖

圖5 淋巴細胞受到LPS刺激前后胞內多肽數目的對比

從實驗結果還可以看出，淋巴細胞經LPS刺激后，多肽數量和種類明顯多于對照組，分析原因可能是淋巴細胞被LPS刺激后激活，分泌出多種細胞因子。在免疫反應過程中，免疫細胞正是通過細胞因子作用于靶細胞來完成免疫應答反應中的關鍵環節。而這些細胞因子的本質就是多肽。所以，淋巴細胞受LPS刺激后新產生很多可能具有免疫調節活性的多肽。

多數多肽是蛋白水解或泛素-蛋白酶體降解得到的產物。多肽一般位于母體蛋白的功能區（蛋白結合區或活性區）中，所以位于這兩個區域的多肽片段能夠保留母體蛋白一定的功能，甚至可以發揮相似的作用。因此，可以基于母體蛋白的功能預測多肽片段的潛在的功能特性[15]。本研究鑒定所得多肽主要來自于兩大類蛋白質：組蛋白(Histone H2A、Histone H2B)和核糖體蛋白(40S ribosomal protein、60S ribosomal protein)。組蛋白是帶正電的核蛋白，有助于將DNA包裝成所有真核細胞共有的核小體。在細胞損傷或細胞信號傳遞過程中，組蛋白通過細胞壞死被動釋放，或作為細胞外的一部分從免疫細胞主動釋放。細胞外組蛋白的功能是殺菌蛋白，通過促進血管內血栓形成來限制感染的擴散或隔離損傷區域，以允許免疫細胞浸潤，清除感染，啟動組織再生和修復[16-17]。因此，根據組蛋白的相關免疫機制，可以為針對急性炎癥性疾病的組蛋白靶向治療提供新的治療策略[18]。核糖體蛋白是核糖體的主要組成物質，也是其發揮細胞內蛋白質合成作用的關鍵物質。它主要通過4個rRNA和80個核糖體蛋白進行加工和組裝，分別成為大（60S）和小（40S）核糖體亞基，每個亞基都具有將mRNA翻譯成蛋白質的特定功能。研究表明，核糖體蛋白除了核糖體的結構作用和mRNA翻譯作用之外，還具有組織特異性的功能作用[19]。有研究人員從40S/60S核糖體中分離純化出一種多肽物質RPS3，這種物質可以參與細胞凋亡信號通路的調控和基因表達的控制，對免疫系統具有非常好的作用[20]。它可以誘導樹突狀細胞的成熟和激活，在先天免疫系統中充當TLR4的新配體，并在適應性免疫系統中存在腫瘤特異性抗原的情況下顯著增加CD8+T細胞的產生。因此，RPS3是用于研發治療和預防癌癥疫苗的新型潛在的重要物質[21,22]。可以發現，這兩大類蛋白可以均在免疫系統中承擔重要角色，因此來源于這兩種蛋白的多肽片段很有可能具備較高的免疫調節活性。

本研究通過Geogle搜索（http://www.google.cn/）、國內專利檢索（http://pss-system.cnipa.gov.cn/s ipopublicsearch/portal/uiIndex.shtml）、國 外 專 利檢索（https://www.wipo.int/pct/en/、https://www.epo.org/）等多個網站對本研究鑒定得到的多肽序列進行搜索比對，確定是否已被報道，未被報道的多肽確定是新發現多肽，檢索結果見表2～3。結果表明在實驗組中新發現112條多肽，在對照組中新發現51條多肽，其中有24條多肽同時存在于實驗組和對照組中。

表2 實驗組新發現多肽

（續表2）

（續表2）

表3 對照組新發現多肽

多肽是由肽鍵連接的氨基酸形成的有機化合物。在特定的溫度和酸堿度下，蛋白質會被酶降解或微生物水解，使多肽片段從母體蛋白中釋放出來[23]。多肽的體外分離過程包括蛋白質選擇、水解、分離和純化，最后一步是確定肽序列、肽結構和相應的功能特性[24]。研究表明，氨基酸序列在很大程度上決定了多肽的功能活性[25]。目前已經證實具有生物活性的多肽具有相似的結構特征，它們的肽鏈長度約在2～30個氨基酸之間，在氨基酸組成上，除了精氨酸、賴氨酸或脯氨酸殘基之外還存在疏水性氨基酸[26]。在本研究中共有139條新發現的多肽，肽鏈長度在8～30個氨基酸之間，大多數多肽也具有上述特征。所以對從淋巴細胞中分離鑒定的多肽組分可能具有的生物活性，后續可以從母體蛋白及其氨基酸序列方面進行深入探究。

3 結論

本文以小鼠脾淋巴細胞為研究對象，對其受到不良刺激前后胞內多肽進行分離和鑒定。實驗分別用LPS和PBS刺激細胞，結合Q Exactive Nano LC-MS/MS(Q Exactive納升液相-四極桿超高分辨軌道阱質譜儀)、數據庫和同源性搜索對細胞中的肽進行鑒定和對比分析，并通過多個網站搜索比對氨基酸序列，確定其是否被公開報道過，為報道過的多肽即為新發現多肽。

根據實驗結果建立了一個“小鼠淋巴細胞多肽數據庫”，該數據庫包含385種多肽，肽鏈長度在8～30個氨基酸之間，其中還包含了139種新發現的多肽。實驗還確定了每條多肽來源的母體蛋白質。所以后續研究可以根據多肽的母體蛋白和氨基酸序列，對其潛在的生物活性進行探究，同時為開發生物活性多肽保健品和特殊醫學用途配方食品奠定了科學的基礎。