建神曲發酵過程中微生物群落結構及功能預測分析

摘 要：為明確建神曲發酵過程中的微生物種類、優勢群落組成及功能特征，采用高通量測序和分析技術對不同發酵時間點的建神曲細菌菌群結構和基因功能進行分析。結果表明，建神曲發酵過程中的細菌種類較少，主要由Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria等4個門細菌組成，不同發酵階段的建神曲共有1個核心菌群;在整個發酵過程中，優勢菌群的豐度出現明顯的變化趨勢，表明建神曲的發酵過程存在清晰的細菌演替過程;PICRUSt基因功能預測分析結果顯示，在豐度排前50的KEGG功能基因KOs中，有22個KOs與酶相關，有49個KOs的豐度在不同發酵時間點之間存在顯著性差異（P<0.05），說明建神曲中的細菌含有豐富的與代謝途徑相關基因，且不同發酵時間點的生理功能不同。

關鍵詞：建神曲;發酵過程;高通量測序;細菌菌群結構;基因功能預測

中圖分類號：Q 938?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：0253-2301（2021）12-0007-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.12.002

Analysis on Microbial Community Structure and Function Prediction Duringthe Fermentation of Jianshenqu

LIAO Qian

（Fujian Pharmaceutical Examination and Inspection Center， Fuzhou， Fujian 350001， China）

Abstract： In order to clarify the microbial species， dominant community composition and functional characteristics during the fermentation of Jianshenqu， the high-throughput sequencing and analysis techniques were used to analyze the bacterial community structure and gene function of Jianshenqu bacteria at different fermentation time points. The results showed that there were few bacterial species in the fermentation process of Jianshenqu， which were mainly composed of Firmicutes， Proteobacteria， Bacteroidetes and Actinobacteria. There was one core flora in Jianshenqu at different fermentation stages. During the whole fermentation process， the abundance of the dominant flora showed an obvious trend of change， indicating that there was a clear bacterial succession process in the fermentation process of Jianshenqu. The results of PICRUSt gene function prediction analysis showed that among the KEGG functional gene KOs with the top 50 abundances， 22 KOs were related to enzymes， and the abundance of 49 KOs was significantly different at different fermentation time points （P<0.05）， indicating that the bacteria in Jianshenqu contained abundant genes related to metabolic pathway， and the physiological functions were different at different fermentation time points.

Key words： Jianshenqu; Fermentation process; High-throughput sequencing; Bacterial community structure; Gene function prediction

建神曲，產自福建泉州，又名泉州神曲、范志曲、百草曲，主要為面粉、小麥、麩皮與砂仁、廣陳皮、廣藿香等藥物混合后發酵而成的加工品[1]。建神曲肇始于明、清年間，迄今已有400多年歷史，在《本草綱目拾遺》《蔡氏藥貼》《藥性考》等古今中醫書中均有詳載[2]。建神曲主要用于傷食胸痞，腹痛吐瀉，痢疾、外感風寒，小兒傷饑失飽以及旅行中水土不服而引起的腸胃不和。《本草綱目拾遺》曰：氣味中和，清香甘淡，能搜風解表，開胸塊隔，調胃健脾，消積進食，和中解酒，止瀉利水，治四時不正之氣，感冒發熱，頭眩咳嗽及傷食腹痛，痞滿氣痛，嘔吐瀉泄痢疾，飲食不進等癥[3]。

根據《福建省中藥飲片炮制規范（2012年修訂）》記載，建神曲的制法是將麩皮、面粉、小麥與砂仁、廣陳皮、廣藿香等藥材經處理后混勻，搗軟壓模制成長方形小塊，蒸1 h，經自然發酵后，取出曬干或低溫干燥，刷凈外表，包裝即得。從現代微生物學的角度來看，建神曲發酵過程的實質為微生物生長、演替、互作和代謝的過程，通過微生物和酶的催化分解作用，使藥物發泡、生衣，產生微生物次生代謝產物、消化酶、低聚糖等新的活性成分協助消化系統發揮正常功能[4-5]。自然發酵工藝由于不同發酵周期的溫濕度條件存在差異且發酵時間較長，造成參與發酵的微生物的數量和種類不確定，會導致同一產地不同批次的產品質量存在差異。利用優勢菌種建立現代混合發酵炮制工藝，可以改善自然發酵過程雜菌多、時間長、產品質量不穩定的弊端[6]。但目前對建神曲發酵過程中的菌群結構組成的研究報道較少。因此，本研究采用高通量測序和分析技術明確建神曲發酵過程中的微生物群落結構和功能特征，為后續建神曲建立穩定可控的現代發酵工藝提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本試驗建神曲樣品采自泉州中僑藥業有限公司的“老范志萬應神曲”，發酵周期約為12 d。本試驗選擇發酵前（0 d）、發酵中期（6 d）和發酵結束（12 d）時進行取樣，編號分別為D0、D6、D12。每個取樣時間點分別隨機取3個建神曲長方形小塊，為減少外界環境雜菌的干擾，用無菌手術刀切取建神曲長方形小塊中心樣品2～3 g，切下的樣品放置于-80℃下保存備用。

1.2 DNA提取與PCR擴增

保存的建神曲樣品DNA采用土壤微生物DNA提取試劑盒（Mobio，USA）提取，提取步驟依據試劑盒操作說明書進行。提取后的基因組DNA采用16S rRNA基因V3～V4區片段通用引物對341F和805R擴增。擴增后的PCR產物用PCR純化試劑盒（Qiagen， Germany）純化，再用Qubit 3.0 熒光定量儀（Invitrogen， USA）進行定量。

1.3 IlluminaMiSeq測序與高通量數據分析

純化后的PCR擴增產物進行Illumina MiSeq平臺高通量測序，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。測序得到的高通量原始數據先去除測序時加入的正反向引物[7]，再根據序列之間的overlap關系將成對的reads拼接成一條完整的序列[8]，對序列進行質控過濾[9]。得到的有效序列再去除嵌合體和冗余序列以及劃分分類操作單元（OTUs）[10]，將OTU代表序列與Ribosomal Database Project（RDP）數據庫進行比對進行物種注釋。利用Mothur軟件和QIIME軟件對生物樣本的alpha多樣性和beta多樣性進行分析[11-12]。

1.4 數據統計分析

在本研究中平均值、標準偏差和P-values采用SPSS軟件計算，多重比較分析采用Tukey′s HSD檢驗;柱狀圖、韋恩圖和熱圖采用R軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 高通量測序數據分析

從表1可知，3個發酵時間點的9個建神曲樣品獲得的16S rRNA基因有效序列數為48372～67995條，OTUs數為156～199個且OUTs覆蓋率（Good′s coverage）均>99%，表明建神曲中的細菌種類較少，且高通量測序獲取的數據量能夠真實地反映樣品的細菌多樣性情況。Alpha多樣性統計分析結果表明，發酵前和發酵結束樣品中的Simpson指數顯著高于發酵中期樣品（P<0.05），而發酵前和發酵結束樣品中的Shannon指數顯著低于發酵中期樣品（P<0.05），表明建神曲在發酵前和發酵結束時的樣品細菌個體數目在群落中分配的均勻程度比發酵中期差，也反應建神曲發酵過程存在細菌優勢菌群的演替過程。根據Beta多樣性距離矩陣進行PCoA分析，結果（圖1）表明相同發酵時間點樣品的微生物結構和組成十分相似，不同發酵時間點樣品的微生物組成結構存在明顯差異。

2.2 建神曲發酵過程中細菌群落結構特征及演替分析

在門水平，建神曲主要由Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria等4個細菌門組成（圖2）。從整個發酵過程來看，4個細菌門的豐度都出現明顯的變化，發酵前期與發酵結束時4個細菌門的差異均達到顯著（P<0.05）或極顯著水平（P<0.01）。發酵前期最優勢菌門Proteobacteria的豐度逐漸下降，次優勢菌門Firmicutes的豐度逐漸上升，到發酵結束時建神曲中的最優勢菌門變為Firmicutes。

在屬水平，建神曲中主要由Lactobacillus、Pseudomonas、Bacillus、Pseudoxanthomonas、Pediococcus、Streptomyces、Flavobacterium、Weissella、Acinetobacter、Clostridium_sensu_stricto、Sphingobacterium、Paenibacillus、Chitinophaga、Comamonas、unclassified_Alcaligenaceae等12個細菌屬組成（圖3）。發酵前期最優勢菌群為Pseudomonas（75.43±12.34）%，發酵中期和發酵結束時下降為（2.32±1.31）%和（6.12±1.32）%;發酵中期的優勢菌群為Lactobacillus、Pseudoxanthomonas和Pediococcus，其豐度分別達到（25.62±14.58）%、（25.55±16.64）%和（19.96±9.02）%，發酵結束時Lactobacillus成為絕對優勢菌屬，豐度達到（71.98±12.16）%，說明整個發酵過程存在明顯的細菌演替過程。

2.3 不同發酵時間點建神曲細菌群落組成比較分析

通過構建韋恩圖對不同發酵時間點建神曲所共有的和特有的OTU數目進行分析（圖4）。從分析結果可以看出，9個建神曲樣品中細菌OTUs總共258個，其中共有OTUs數為166個，分別占發酵前期、發酵中期和發酵結束時OTUs總數的75.11%、74.44%和80.19%;而發酵前期、發酵中期和發酵結束時的建神曲中的特有OTUs數分別為19、8和4個，分別占OTUs總數8.60%、3.59%和1.93%;說明盡管不同發酵時期建神曲中的優勢菌群不同，但不同發酵時期建神曲中的菌群種類基本一致。

2.4 建神曲細菌群落功能PICRUSt預測分析

對細菌的基因功能進行預測有助于理解建神曲中化學成分的轉化過程。通過PICRUSt分析，9個建神曲樣品共鑒定出5605個KEGG功能基因KOs，對應于41個2級功能層和328個3級功能層。選擇豐度前50的KEGG功能基因KOs繪制熱圖（圖5）。統計結果顯示，50個優勢KOs中有22個KOs與酶相關，且除K09687外剩余49個KOs豐度在不同發酵點均存在顯著性差異（P<0.05）;表明建神曲中含有豐富的與代謝途徑相關的細菌功能基因以及不同發酵時間點微生物所起的功能不同。

3 結論與討論

自然界中蘊藏著大量未被人們熟知的微生物資源，使用傳統鑒定方法只能對可培養微生物進行鑒定，由于嚴格的專性厭氧環境和特殊的營養需求，使得其很難得到樣本中的整個微生物結構組成情況[13]。隨著高通量測序技術的發展，這一問題得到了解決。近幾年，國內外學者通過高通量技術在多種環境樣品中的微生物多樣性方面都取得了初步進展[14]。本研究利用高通量測序技術對建神曲發酵樣品中微生物菌落結構進行研究，確定了建神曲樣品中的細菌主要由Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria等4個細菌門組成。從高通量測序數據分析，建神曲中的細菌種類相對簡單，但核心菌群基本一致，這可能與建神曲中的藥物成分對細菌物種存在自然選擇作用有關。

優勢菌種發酵技術是利用傳統發酵菌種中的某種單一特定的有益菌株進行發酵，發酵時間短、容易形成規范化標準化發酵，同時可減少雜菌的產生[6]。從菌群結構和PICRUSt基因功能預測分析結果來看，各發酵時間點的建神曲細菌優勢菌群和生理功能存在顯著的差異（P<0.05），說明在建神曲發酵過程中不同階段的細菌所起的作用不同;從差異變化趨勢分析，發酵結束時的優勢菌群在整個發酵過程中的豐度是逐漸增加的，說明建神曲在整個發酵過程中存在清晰的細菌演替過程，而優勢菌群是需要在合適的環境下逐步演替顯現出來。因此，如果僅采用某種單一的特定菌種進行發酵并不能達到混合菌種發酵的互補優勢[5]。因此，分階段探索建神曲中發酵過程中的優勢菌株及功能，采用多種益生菌混合接力發酵的生產工藝，或能達到更好的效果。

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（責任編輯：柯文輝）

收稿日期：2021-10-12

作者簡介：廖茜，女，1985年生，主管藥師，主要從事藥物微生物方面的研究。