1株產γ-氨基丁酸菌株的分離鑒定及發酵特性研究

陳國偉 賈嬌 杜丹 解修超 耿敬章 鄧百萬

摘 要：對謝村黃酒酒曲中細菌進行分離，利用薄層層析法定性、柱前衍生高效液相色譜法定量篩選出1株產γ-氨基丁酸（Gama-aminobutyric，GABA）能力的菌株N1，通過對該菌株進行形態學觀察、生理生化試驗、16S rDNA序列分析鑒定，并繪制其生長曲線，研究谷氨酸鈉（L-MSG）的添加量、發酵時間、發酵溫度等對菌株N1發酵產GABA含量的影響。結果表明：經初篩得到的菌株N1，復篩測得發酵液中GABA含量為448.6 mg·L-1。結合形態學、生理生化及分子生物學鑒定菌株N1為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，菌株N1在液體培養0～4 h處于延滯期，4～12 h處于指數期，12～16 h為穩定期，16 h之后為衰退期; 菌株N1最適培養條件為發酵時間72 h、發酵溫度36℃、pH值6、接種量2%、裝液量100 mL、谷氨酸鈉添加量1%，在此條件下菌株N1發酵產GABA含量可達583.5 mg·L-1。

關鍵詞：謝村黃酒酒曲;γ-氨基丁酸;分離鑒定;發酵特性

中圖分類號：Q 93-331? 文獻標志碼：A? 文章編號：0253-2301（2021）12-0012-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.12.003

Isolation， Identification and Fermentation Characteristics of γ-aminobutyric acid-producing Strains

CHEN Guo-wei1， JIA Jiao1， DU Dan1，3， XIE Xiu-chao1，2*， GENG Jing-zhang1， DENG Bai-wan1，2

（1. College of Biological Science and Engineering， Shaanxi University of Technology， Hanzhong， Shaanxi 723000， China;

2. Shaanxi Engineering Research Center of Edible and Medicinal Fungi， Hanzhong， Shaanxi 723000， China;

3. Xianyang Academy of Agricultural Sciences， Xianyang， Shaanxi 712000， China）

Abstract： The bacteria in the yellow rice wine koji of Xiecun were isolated， and a strain N1 which was capable of producing γ-aminobutyric acid （GABA） was quantitatively screened by using the methods of thin layer chromatography and precolumn derivatization high performance liquid chromatography. The morphological observation， physiological and biochemical tests， 16S rDNA sequence analysis and identification of the strain were carried out， and its growth curve was plotted， in order to study the effects of the addition amount of sodium glutamate （L-MSG）， fermentation time and temperature on the content of GABA produced by the strain N1. The results showed that the content of GABA in the fermentation broth was 448.6 mg·L-1 after the initial screening. Combined with the identification of morphology， physiology， biochemistry and molecular biology， the strain was identified as Bacillus subtilis. The strain was in the lag phase from 0 to 4 h after the liquid culture， the exponential phase from 4 to 12 h， the stable phase from 12 to 16 h， and the decline phase after 16 h. The optimum culture conditions for the strain N1 were as follows： fermentation time 72 h， fermentation temperature 36℃， pH value 6， inoculation amount 2%， liquid volume 100 mL， and sodium glutamate 1%. Under these conditions， the content of GABA produced by the strain N1 could reach 583.5 mg·L-1.

Key words： Yellow rice wine koji of Xiecun; γ-aminobutyric acid; Isolation and identification; Fermentation characteristics

黃酒（Huangjiu）源于中國，是世界三大釀造酒之一，被譽為“液體面包”[1-3]，具有悠久的文化歷史，是我國古代禮儀的象征[4]。謝村黃酒產自陜西省漢中市洋縣，起源于上古夏商時期，民間有“南有紹興加飯，北有謝村黃酒”之說，謝村黃酒是一種具有營養保健功能的發酵型低酒精度酒，2010年已被納入陜西省第一批非物質文化遺產[5]。據鑒定，謝村黃酒富含17種人體必需氨基酸，總含量高達115633.66 mg·L-1，比啤酒高11倍，比紅葡萄酒高8倍，比紹興加飯酒高出1倍多[6]。“曲為酒之骨”[7-8]，酒曲作為酒中產生各種風味物質的動力源泉，其中微生物起到重要作用，微生物之間存在著共生、互生、寄生、拮抗的作用，在麥曲傳統制作工藝中，微生物逐漸形成一個復雜并與環境相適應的微生物區系，決定著黃酒的品質[9]。我國目前對黃酒研究仍然停留在生理效應和活性物質，對于酒曲研究主要集中于微生物產酶，功能活性成分γ-氨基丁酸（GABA）的研究較少，因此本研究對于黃酒中的新型功能因子GABA的研究有潛在應用價值。

γ-氨基丁酸（GABA）是非蛋白組織氨基酸，產生機理是由前體物質谷氨酸（L-glu）或谷氨酸鈉（L-MSG）經谷氨酸脫羧酶（GAD）催化作用產而來，是動物神經中樞系統的主要抑制性遞質[10]。GABA具有舒降血壓、調節抗心律失常[11-12]、抗驚厥、鎮痛[13-15]等功能。2009年被國家衛生部配準為新資源食品，成為研究的熱門。謝廣發等[16]研究發現我國的古越龍山紹興黃酒中GABA含量達167～360 g·L-1;龔金炎等[17]從黃酒浸米液中篩選出產GABA植物乳桿菌，測得其發酵液中GABA濃度為1.02 g·L-1。本研究通過對謝村黃酒酒曲中分離的細菌，采用薄層層析法初篩定性和高效液相復篩定量，并對菌株N1進行鑒定及其發酵特性初步研究，探討菌株N1在不同條件下的發酵能力，旨在為菌株N1用于生產GABA的研究提供科學參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料 黃酒酒曲，由陜西秦洋長生酒業有限公司提供。

1.1.2 儀器設備 電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司，BSA8201）、生化培養箱（上海新苗醫療器械制造有限公司，SPX25085HH）、顯微鏡（上海普赫興電科技有限公司，奧林巴斯CX22）、PCR擴增儀（上海恒久醫療器械有限公司，TA40英國Techne）、電泳儀（上海天能科技有限公司，TANOAEPS30）、高效液相色譜儀（廣東科曉分析儀器公司，Agilent HPLC1220）。1.1.3 培養基 牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂15.0 g，pH自然，蒸餾水1000 mL。

發酵培養基：葡萄糖10.0 g、酵母膏10.0 g、蛋白胨5.0 g、硝酸鈉3.0 g、七水硫酸鎂0.02 g、硫酸錳0.001 g、氯化鈉0.001 g、七水硫酸亞鐵0.001 g、10 g L-MSG、pH 6.0。

其他培養基：甲基紅試驗培養基、V-P試驗培養基等配制方法參照《常見細菌系統鑒定手冊》[18]。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃酒酒曲中細菌的分離 酒曲樣本放在滅菌的研缽中粉碎，37℃、140 min振蕩30 min，稀釋涂布平板，37℃恒溫培養。觀察并挑取單菌落多次劃線純化，純化后的平板備用，菌液于50%甘油Ep管保藏。

1.2.2 產GABA菌株的篩選

（1）產GABA菌株的初篩。薄層層析法測定見參考文獻[19] 。①發酵培養：以3%的接種量轉接100 mL（250 mL三角瓶）發酵培養基中，37℃、140 r·min-1搖瓶振蕩發酵72 h。②發酵液處理：吸取2 mL發酵液于EP管，1000 r·min-1 4℃離心5 min，取上清液待測。③硅膠板的活化：硅膠板于烘箱105℃活化1.5 h，待用。④展開劑擴散層析缸：將展開劑倒入層析缸底部1 cm，蓋上玻璃蓋，靜置1 h。⑤點樣、層析、顯色：以1 mg·mL-1 GABA標準液和L-MSG標準液為對照，取10 μL發酵上清液，迅速點樣后吹干層析，待溶劑擴散至硅膠板上1～2 cm處取出，立即噴顯色劑置于85℃烘箱顯色15 min。

（2）產GABA菌株的復篩。PITC柱前衍生化法高效液相測定參照QB/T 4356-2012《黃酒中游離氨基酸的測定 高效液相色譜法》[20]。①發酵液處理：同薄層層析法的處理方法相同，得到發酵上清液即為樣品原液。②樣品衍生化、萃取、標準工作液衍生。③GABA標品波長掃描：配置不同梯度GABA標品液，衍生化后進行紫外分光光度計全波長掃描，確定最終檢測波長。④色譜條件：檢測波長為掃描波長。⑤標準工作液的配制。⑥測定：進樣量10 μL，以峰面積為y軸，濃度為x軸繪制標準曲線。

1.2.3 產GABA菌株的鑒定

（1）形態學觀察 觀察37℃培養條件下的形態特征，包括邊緣、顏色和透明度等，用革蘭氏染色觀察菌體形態和大小[21]。

（2）細菌生理生化試驗 甲基紅試驗（M.R）、V-P試驗、檸檬酸鹽試驗等參照《常見細菌系統鑒定手冊》[18]。

（3）分子生物學鑒定 水煮法提取細菌基因組，采用細菌通用引物1492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）和27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）擴增目的片段，PCR擴增反應條件為：94℃預變性5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，33個循環;72℃延伸10 min，4℃保存。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后測序，測序結果整理后提交進行BLAST比對，利用Mega 7.0構建系統發育樹。

1.3 目標菌株的特性初步研究

1.3.1 目標菌株的生長曲線 經篩選鑒定得到的菌株為目標菌株N1，用無菌槍頭取適量菌株N1接種于50 mL/250 mL的發酵培養基中，37℃、140 r·min-1條件下振蕩培養，每2 h測定OD600值[22]，并繪制生長曲線。

1.3.2 發酵條件對目標菌株產GABA的影響

（1）谷氨酸鈉（L-MSG）添加量對菌株N1發酵產GABA含量的影響 L-MSG是產生GABA的前體物質，取活化后的菌液分別接種于發酵培養基中培養，測定發酵液GABA含量，確定最佳添加量。

（2）發酵時間對菌株N1發酵產GABA含量的影響 將種子液按3%的接種量接種于最優谷氨酸鈉添加量的基礎培養基，37℃，140 r·min-1條件下振蕩培養24、48、72、84、96 h，測定發酵液GABA含量，確定最佳發酵時間。

（3）發酵溫度對菌株發酵N1產GABA含量的影響 將種子液接種于最優谷氨酸鈉添加量的基礎培養基，分別置于溫度28℃、32℃、36℃、40℃、44℃條件下，140 r·min-1振蕩培養72 h，測定發酵液GABA含量，確定最佳發酵溫度。

（4）初始pH對菌株N1發酵產GABA含量的影響 將種子液接種于最優谷氨酸鈉添加量的基礎培養基，初始pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，140 r·min-1振蕩培養72 h，測定發酵液GABA含量，確定最佳pH。

（5）裝液量對菌株N1發酵產GABA含量的影響 將種子液接種于最優谷氨酸鈉添加量的基礎培養基，裝液量為25、50、100、150、200、250 mL，140 r·min-1振蕩培養72 h，測定發酵液GABA含量，確定最佳裝液量。

（6）接種量對菌株N1發酵產GABA含量的影響 將種子液接種于最優谷氨酸鈉添加量的基礎培養基，接種量為1%、2%、3%、4%、5%，140 r·min-1振蕩培養72 h，測定發酵液GABA含量，確定最佳接種量。

2 結果與分析

2.1 黃酒酒曲細菌分離

稀釋涂布、劃線法對黃酒酒曲樣品進行單菌落分離，4℃平板保藏和50%甘油保藏，便于后續試驗。

2.2 產GABA菌株N1篩選

2.2.1 產GABA菌株N1的初篩結果 菌株的發酵液離心后，進行薄層層析法初篩，其中N1菌株可利用1%L-MSG生成GABA（圖1）。由圖1可知，N1菌株發酵液與標液有一致的顯色位置，顯色較深，初步篩選出其具有產GABA的能力。

2.2.2 產GABA菌株N1的復篩結果 發酵液與標品GABA衍生化處理后，對衍生樣品進行波長掃描，確定波長為254 nm，通過各濃度GABA衍生物測定結果比對分析，確定GABA保留時間為5.132 min，測定結果見圖2和圖3，以出峰面積為y軸，濃度為x軸，得到GABA濃度在0～80 μg·mL-1的標準曲線線性回歸方程為y=12.522x-13.068（R2=0.9992），曲線有較好的線性相關關系。

通過比對發現，初篩菌株的發酵液樣品在相同時間出現峰值。經計算發酵液中GABA含量為448.6 mg·L-1，將其確定為目標菌株進行后續特性研究。

2.3 產GABA目標菌株N1的鑒定

2.3.1 形態學特征鑒定 牛肉膏蛋白胨平板上生長的菌株表面褶皺無光澤，邊緣微凸不整齊并向四周蔓延，顏色乳白色，濕潤不透明，經革蘭氏染色鏡檢為紫色短桿狀，陽性桿菌（圖4）。

2.3.2 生理生化試驗鑒定結果 參照《常見細菌系統鑒定手冊》[18]對比試驗結果，并結合形態學特征，初步鑒定N1為芽孢桿菌屬，試驗結果見表2。

2.3.3 分子生物學鑒定 以菌株N1總DNA為模板，經PCR擴增并檢測合格后送至生工生物工程（上海）股份有限責任公司測序，并構建系統發育樹（圖5）。最終鑒定菌株N1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.4 菌株N1生長特性

由圖6可知，菌株0～4 h為延滯期，4～12 h為指數期，12～16 h為穩定期且時間較短，16 h之后進入衰退期，70 h后大部分菌株死亡菌體釋放，菌株在該培養基上有一定特異性，此后試驗均以對數期為研究對象。

2.5 不同發酵條件對菌株N1發酵產GABA的影響

2.5.1 谷氨酸鈉（L-MSG）添加量對菌株N1發酵產GABA含量的影響 前體L-MSG可在谷氨酸脫羧酶存在條件下催化生產GABA[23]。由圖7可知，添加0～4%的L-MSG發酵液均可產GABA，添加量為1%時GABA濃度最高，為538 mg·L-1，超過1%時會略有下降，不添加L-MSG的空白發酵液中有少量GABA，可能與基礎培養基

成分有關。

2.5.2 發酵時間對菌株N1發酵產GABA含量的影響 發酵時間的長短直接影響微生物的代謝產物量。由圖8可知，發酵72 h時GABA含量最高，此后略有下降，說明該菌株在穩定期和衰退期會產生酶催化前體物質合成GABA，故確定菌株N1的最佳發酵時間為72 h。并推測該酶為谷氨酸脫羧酶。

2.5.3 發酵溫度對菌株N1發酵產GABA含量的影響 溫度是影響微生物生長代謝的重要因素。由圖9可知，N1菌株最適宜的發酵溫度在 36～44℃，在此區間產GABA的能力較強，40℃時達到最大。因此，考慮后繼試驗條件將36℃作為發酵溫度。

2.5.4 初始pH對菌株N1發酵產GABA含量的影響 初始pH不同的培養基會反應菌株對酸堿度的生長耐受情況。由圖10可知，在pH 5.5～6.0，GABA含量隨pH的升高而增加，pH 6.0時最高，為564 mg·L-1，之后隨pH升高而降低，由于酒曲微生物實際所處環境偏弱酸性，因此推測菌株可在弱酸性環境穩定生產GABA。

2.5.5 裝液量對菌株N1發酵產GABA含量的影響 不同微生物對氧氣的需求量不同，對于需氧菌來說，溶氧量對發酵產物有著直接影響。以 250 mL 三角瓶中不同裝液量來考察溶氧量對菌株N1發酵GABA的影響。由圖11可知，隨著裝液量的增加GABA含量呈現先增加后減少的趨勢，裝液量為100 mL時GABA含量最大，為583.5 mg·L-1，溶氧量較少時對菌株生長產生影響，導致自身產酶較少，從而影響產GABA的能力。

2.5.6 接種量對菌株發酵產GABA含量的影響 接種量的多少可影響發酵液中的活菌量。由圖12可知，隨著接種量的增加發酵液中GABA含量先增加后減小，但接種量對GABA產量整體影響較小。因此，以2%接種量作為發酵培養基的最佳接種量。

3 結論

GABA作為新型功能因子，神經營養物質，具有降血壓、治療精神性疾病、促進睡眠等多種生理功能[24-25]。羅少華等[26]利用大腸桿菌制備γ-氨基丁酸并應用于工業化生產，但大腸桿菌會產生內毒素，在安全性方面存在爭議。枯草芽孢桿菌是一種發酵過程中無內毒素產生的食品級微生物，獲得美國FDA資格認證[27]，是酒曲中的優勢菌，產蛋白酶和糖化酶優勢明顯并與黃酒風味物質密切相關[28]。因此，本研究利用枯草芽孢桿菌代謝生產GABA應用于黃酒和其他發酵食品行業的思路可行，研究并利用該微生物的特性，在后期生產富含GABA食品中具有潛在價值。

本研究通過從謝村黃酒酒曲中分離、篩選得到的1株產GABA能力的菌株N1，經初篩定性和復篩定量測得發酵液GABA含量達448.6 mg·L-1，經過形態學、生理生化試驗、分子生物學鑒定確定菌株N1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）;生長曲線表明該菌株在液體培養基0～4 h為延滯期，4～12 h為指數期，12～16 h為穩定期，16 h之后為衰退期。發酵特性試驗結果顯示，菌株N1最適發酵條件為pH 6.0、發酵溫度37℃、裝液量100 mL、發酵時間72 h，谷氨酸鈉添加量1%，接種量2%。在此條件下菌株N1發酵液產GABA含量為583.5 mg·L-1。本試驗結果表明，菌株N1不僅能直接發酵代謝生產富含GABA的黃酒，還能間接發酵代謝產酶促進GABA的生產，研究結果可為開發富含GABA黃酒或其他功能食品提供參考依據。

參考文獻：

[1]全國食品工業標準化技術委員會釀酒分技術委員會.黃酒：GB/T 13662-2008[S].北京：中國標準出版社，2009.

[2]陳玉香，葉汶坤，何冬萍，等. 酵母菌對紅曲黃酒風味物質形成的影響[J].中國食品學報，2015，15（7）：218-223.

[3]朱豪.廣東客家黃酒中γ-氨基丁酸的研究[D].廣州：仲愷農業工程學院，2014.

[4]謝廣發.黃酒釀造技術[M].北京：中國輕工業出版社，2010.

[5]譚新喜，李夢潔，李新生，等.謝村黃酒發展狀況及策略研究[J].現代食品，2018（11）：1-4.

[6]杜丹. 謝村黃酒酒曲產γ-氨基丁酸菌株的篩選及其應用研究[D].漢中：陜西理工大學，2020.

[7]薛景波.黃酒接種生麥曲微生物群落結構及分離培養微生物的產酶、產香性質分析[D].無錫：江南大學，2016.

[8]胡文浪.黃酒工藝學[M].北京：中國輕工業出版社，1998.

[9]曹鈺，陳建堯，謝廣發，等. 黃酒麥曲天然發酵中真菌群落的成因初探[J].食品與生物技術學報，2008（5）：95-101.

[10]王輝，項麗麗，張鋒華，等. γ-氨基丁酸（GABA）的功能性及在食品中的應用[J].食品工業，2013，34（6）：186-189.

[11]SEGAL S A.Blockade of central nervous system GABAergic tone causes sympathetic mediated increases in coronary vasculas resistance in cats[J].Circulation Res，1984，55（3）：404-415.

[12]DUNN K，PEPPLETT-WILDMAN C M，KELLEY S P，et al.Currentperspective on the location and function of gamma-aminobutyric acid（GABA）and its metabolic partners in the kidney[J].J Nephrol Urol Res，2014，2（2）：47-57.

[13]董玲，姚英政，梁強，等.米糠中產γ-氨基丁酸細菌分離及其接種發酵研究[J].中國釀造，2018，37（1）：63-68.

[14]徐林敏.巨大芽孢桿菌X1谷氨酸脫羧酶及γ-氨基丁酸產條件的研究[D].南京：南京農業大學，2015.

[15]孫月霎，祝晉芳，馮源，等.γ-氨基丁酸與哮喘的關系[J].中國醫藥指南，2010（3）：40-42.

[16]謝廣發，戴軍，趙光鰲，等. 黃酒中的γ-氨基丁酸及其功能[J].中國釀造，2005（3）：49-50.

[17]龔金炎，謝湉，樓堅，等.黃酒浸米液中產γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選和鑒定[J].工業微生物，2015，45（6）：26-31.

[18]東秀珠.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001：162-167.

[19]邱文軍. 產谷氨酸脫羧酶菌株篩選及生產γ-氨基丁酸的研究[D].無錫：江南大學，2014.

[20]全國食品發酵標準化中心.QB/T 4356 -2012黃酒中游離氨基酸的測定高效液相色譜法[S].北京：中國輕工業出版社，2012.

[21]劉軍生，解修超，羅陽蘭，等.抗鎘內生細菌阿耶波多氏芽孢桿菌的分離鑒定及生物學特性[J].生物技術通報，2019，35（2）：64-72.

[22]HEKMAT D，BAUER R，NEFF V.Optimization of the microbial synthesis of dihydroxyacetone in a semi-continuous repeated-fed-batch process byinsitu immobilization of Gluconobacter oxydans[J].Process Biochemistry，2006，42（1）：71- 76.

[23]劉婷婷，楊套偉，張術聰，等.高效轉化L-谷氨酸為γ-氨基丁酸菌株的篩選、鑒定及初步優化[J].食品與生物技術學報，2010，29（5）：742-747.

[24]JUNG-ICK B，YONG S Y，SUNG-EUN C，et al.Safety and Efficacy of Gamma-Aminobutyric Acid from Fermented Rice Germ in Patients with Insomnia Symptoms：A Randomized，Double-Blind Trial[J].Journal of Clinical Neurology，2018，14（3）：291-295.

[25]SHUKLA D K，WIJTENBURG S A，CHEN H J，et al.Anterior Cingulate Glutamate and GABA Associations on Functional Connectivity in Schizophrenia[J].Schizophrenia bulletin，2019，45（3）：647-658.

[26]羅少華，紹偉，仇敏，等.包埋-交聯法固定大腸桿菌細胞制備γ-氨基丁酸的研究[J].中國釀造，2011（11）：142-145.

[27]丁偉.谷氨酸脫羧酶重組枯草芽孢桿菌的構建及其發酵優化[D].合肥：安徽醫科大學，2015.

[28]杜丹，解修超，李新生，等.黃酒酒曲微生物及其代謝產物的研究進展[J].生物資源，2019，41（2）：104-111.

（責任編輯：林玲娜）

收稿日期：2021-11-28

作者簡介：陳國偉，男，1995年生，在讀碩士研究生，主要從事微生物資源保育及應用開發研究。

通信作者：解修超，男，1982年生，博士，副教授，主要從事微生物資源開發與利用研究（E-mail：xiexiuchao@126.com）。

基金項目：陜西省重點研發計劃（2019NY-134）;陜西省教育廳2020年服務地方專項科學研究計劃（20JC010）。