基于LC-Q/TOF-MS技術分析特基拉芽胞桿菌發酵產物的功能成分

陳崢 劉波 史懷 陳梅春 陳倩倩 王階平 鄧文瓊

摘 要：在微生物發酵床領域，特基拉芽胞桿菌Bacillus tequilensis有良好的應用前景，分析該菌代謝產生的功能物質，為功能菌株的開發和利用提供理論基礎。以1株分離自養豬發酵床的特基拉芽胞桿菌Bacillus tequilensisFJAT-49377為試驗材料，運用LC-Q/TOF-MS技術檢測其發酵產物，質譜數據經分子特征提取后，與Metlin數據庫進行比對，從而獲得代謝產物成分信息。結果表明：從特基拉芽胞桿菌Bacillus tequilensisFJAT-49377測定代謝產物24種，包括了脂肽類、鞘脂類、脂肪酸胺、抗生素和三肽等物質種類。其中，高匹配成分（匹配得分≥90分）有16種，包括二氫神經鞘氨醇、植物鞘氨醇、表面活性素、烏達霉素B等;在高匹配成分中，相對含量≥0.5%的成分有4種，分別為2，6二氨基7羥基壬二酸（匹配得分96.32分，相對含量1.01%）、

3氧代5S氨基己酸（匹配得分98.90分，相對含量0.88%）、表面活性素（匹配得分90.47分，相對含量0.86%）和胍基前克拉維胺（匹配得分91.69分，相對含量0.61%）。

關鍵詞：特基拉芽胞桿菌;發酵產物;養豬發酵床;功能物質;液相色譜四級桿飛行時間質譜

中圖分類號：S 432.45?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：0253-2301（2021）12-0019-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.12.004

Analysis of the Functional Components of Fermentation Products ofBacillus Tequilensis by LC-Q/TOF-MS

CHEN Zheng， LIU Bo*， SHI Huai， CHEN Mei-Chun， CHEN Qian-Qian， WANG Jie-Ping， DENG Wen-Qiong

（Institute of Agricultural Biological Resources， Fujian Academy ofAgricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： Bacillus tequilensis had good application prospect in the field of microbial fermentation bed. The analysis of the functional materials produced by the metabolism of this strain would provide theoretical basis for the development and utilization of functional strains. One strain of Bacillus tequilensis FJAT-49377 which was isolated from the fermentation bed for pig raising was used as the experimental material to detect the fermentation products by LC-Q/TOF-MS technology. After the extraction of molecular feature， the mass spectrometry data were compared with the Metlin database to obtain the component information of the metabolites. The results showed that 24 metabolites were determined from Bacillus tequilensis FJAT-49377， including lipopeptides， sphingolipids， fatty acid amines， antibiotics and tripeptides， among which there were 16 highly matched components （matching score≥90）， including dihydroneurosphine， phytosphingosine， surfactin， Udamycin B， etc. Among the highly matched components， there were 4 components with the relative content≥0.5 %， which were 2，6-diamino-7-hydroxy-nonadiic acid （matching score of 96.32 points， relative content of 1.01%）， 3-oxo-5S-amino-hexanoic acid （matching score of 98.90 points， relative content of 0.88%）， surfactin （matching score of 90.47 points， relative content of 0.86%）， and guanidine-precursor clavulanate （matching score of 91.69 points， relative content of 0.61%）.

Key words： Bacillus tequilensis; Fermentation products; Fermentation bed for pig raising; Functional material; Liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry

微生物發酵床（Microbial fermentation bed，MFB）利用墊料吸收畜禽排泄糞尿，通過墊料中的微生物進行原位發酵，達到分解消納、去污除臭的效果，從而實現畜禽清潔、環保養殖[1]。微生物發酵床是微生物與墊料共同組成復雜的微生態環境[2]，微生物起到物質、能量轉化作用，是發酵床良性運作的核心[3-4]。

學者通過高通量測序研究表明，芽胞桿菌是微生物發酵床中的優勢種群[5]。芽胞桿菌具有益生、防病、除臭、降污、抗菌等生物活性，在微生物發酵床養殖領域中被廣泛應用[6]。劉波等[7]研究了養豬微生物發酵床芽胞桿菌空間生態位特征，共鑒定出芽胞桿菌目6個科24個屬種類。劉國紅等[8]研究表明發酵床中芽胞桿菌含量達到4.41×108 cfu·g-1，芽胞桿菌屬、類芽胞桿菌屬、賴氨酸芽胞桿菌屬為優勢菌。其中，芽胞桿菌屬的特基拉芽胞桿菌Bacillus tequilensis較普遍地分布在發酵床的生境中[8-9]，在發酵床上具有良好的應用前景[10]。

研究前期，作者從養豬發酵床的生境中分離到1株特基拉芽胞桿菌Bacillus tequilensisFJAT-49377，具有耐高溫的特性，并具備促進植物生長的活性[11]。該菌株在60℃溫度脅迫下，仍保持較強的生長能力，活菌數達5.28×107 CFU·mL-1，同時該菌株能夠分泌吲哚-3-乙酸（IAA），顯著提高番茄種子發芽率。為了開發與利用該特基拉芽胞桿菌菌株資源，運用液相四級桿飛行時間質譜（LC-Q/TOF-MS）檢測，采用非靶向性方法和Metlin數據庫比對，結合文獻報道研究其成分。本研究為進一步詮釋發酵床原生菌對發酵床消納糞污機制，為發酵床的健康運行提供理論指導，也為該活性菌株的開發與利用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 特基拉芽胞桿菌Bacillus tequilensisFJAT-49377，分離自福建省寧德市養豬場發酵床墊料，由福建省農業科學院生物資源研究所提供，采用-80℃甘油冷凍保存。

1.1.2 試驗試劑 甲醇（色譜純，美國杰帝貝柯公司），甲酸（上海安譜科學儀器有限公司）。

1.1.3 供試培養基 LB固體培養基，LB液體培養基。

1.1.4 試驗儀器 液相色譜四級桿飛行時間質譜聯用儀Agilent 1260/6520（美國安捷倫科技公司）; 恒溫培養振蕩器ZHWY2102C（上海智城分析儀器制造有限公司）;電子天平AL104[梅特勒托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 試驗方法

1.2.1 發酵產物提取方法 取出特基拉芽胞桿菌Bacillus tequilensis FJAT-49377菌株，采用平板劃線法活化菌種，挑取單菌落于LB培養基中，于30℃、170 r·min-1條件下培養48 h后得到發酵液。發酵液于8000 r·min-1離心10 min，去除菌體后取上清液，與等體積甲醇萃取2 h，12000 r·min-1離心5 min，取上清，用0.22 μm濾膜過濾后，置于進樣瓶，于4℃冰箱保存，待檢。

1.2.2 液相色譜質譜分析條件 色譜質譜條件： 色譜柱為Agilent Zorbax Extend C18 （2.1×150 mm，1.8-micron）;柱溫： 35℃;進樣量： 2 ml;流動相A=0.1%甲酸+水;流動相B=甲醇;流速：0.3 ml·min-1;梯度洗脫程序：0 min、5%B;8 min、5%B;38 min、95%B;45 min、95%B;47 min、5%B;55 min、5%B。

質譜運行條件：正離子模式;干燥氣溫度：350℃，干燥氣流速：8 L·min-1;霧化器壓力：30 psig;毛細管電壓：3500 V;裂解電壓：175 V;Skimmer：65.0 V;質量范圍：100～3000 m/z。

1.2.3 數據分析 得到數據后利用Agilent Mass Hunter工作站軟件中的分子特征提取（MFE）工具提取并生成數據，經Metlin譜庫檢索后生成數據列表。高匹配成分篩選：以與metlin庫的匹配得分為指標，篩選匹配得分（score）≥90分的成分，為高匹配（得分）的成分。高匹配成分、高含量成分篩選：從以上篩選出的高匹配成分中，篩選相對含量≥0.5%的成分，為高（相對）含量成分。

2 結果與分析

2.1 特基拉芽胞桿菌Bacillus tequilensis FJAT-49377發酵產物檢測

特基拉芽胞桿菌Bacillus tequilensis FJAT-49377發酵產物的總離子流圖見圖1 。

2.2 特基拉芽胞桿菌Bacillus tequilensis FJAT-49377發酵產物成分分析

由表1可知，特基拉芽胞桿菌Bacillus tequilensis FJAT-49377發酵產物的質譜數據，通過分子特征提取（MFE）和Metlin譜庫檢索，初步鑒定結果成分有24種。這些成分包括：（1）脂肽類1種，為表面活性素（Surfactin）;（2）鞘脂類及衍生物3種，為植物鞘氨醇（Phytosphingosine）、二氫神經鞘氨醇 （C16 Sphinganine）、Enigmol;（3）脂肪酸胺2種，硬脂酰胺 （Stearamide）和軟脂酰胺（Palmitic amide）;（4）抗生素2種，為烏達霉素B（Urdamycin B）、雙效菌素（Zwittermicin A）;（5）三肽類6種，為谷氨酸精氨酸精氨酸（Glu Arg Arg）、異亮氨酸天冬酰胺天冬酰胺（Ile Asn Asn）和脯氨酸谷氨酰胺谷氨酰胺（Pro Gln Gln）等;（6）其他化合物10種，為2，6二氨基7羥基壬二酸（2，6-diamino-7-hydroxy-azelaic acid）、3氧代5S氨基己酸（3-oxo-5S-amino-hexanoic acid）和胍基前克拉維胺（Guanidinoproclavaminic acid）等。

2.3 特基拉芽胞桿菌Bacillus tequilensis FJAT-49377發酵產物中高匹配成分分析

特基拉芽胞桿菌FJAT-49377發酵產物中，檢出的高匹配成分（匹配得分≥90分）共16種，相對含量占總成分的5.41%（表2）。這些高匹配成分為二氫神經鞘氨醇（匹配得分97.98分）、植物鞘氨醇（匹配得分95.06分）、表面活性素（匹配得分90.47分）、烏達霉素B（匹配得分91.01分）和胍基前克拉維胺 （匹配得分90.47分）等。其中，匹配得分最高的為3氧代5S氨基己酸，匹配得分為98.90分，相對含量是0.88%。

2.4 特基拉芽胞桿菌Bacillus tequilensis FJAT-49377發酵產物中高匹配、高含量成分分析

特基拉芽胞桿菌FJAT-49377發酵產物中高匹配（匹配得分≥90分）、高含量（相對含量≥0.5%）成分共4個，相對含量占總成分的3.36%（表3）。這些高匹配、高含量成分為：2，6二氨基7羥基壬二酸（匹配得分96.32分，相對含量1.01%）、3氧代5S氨基己酸（匹配得分98.90分，相對含量0.88%）、表面活性素（匹配得分90.47分，相對含量0.86%）和胍基前克拉維胺（匹配得分91.69分，相對含量0.61%）。

3 討論與結論

特基拉芽胞桿菌具有重要的生物活性，廣泛應用在農業生產領域。在作物種植方面，Ma等[12]發現特基拉芽胞桿菌具備殺線蟲的活性，同時該菌還具有拮抗植物病原的特性，對稻瘟病菌Magnaporthe oryzae[13]、青枯雷爾氏菌Ralstonia solanacearum[14]、西瓜枯萎病Fusarium oxyporum[15]。在動物養殖方面，特別是在微生物發酵床養豬上，特基拉芽胞桿菌較普遍地分布在發酵床的生境中，在微生物發酵床上具有良好的應用前景[10]。劉國紅等[8]統計了養豬微生物發酵床中芽胞桿菌的數量分布，結果表明特基拉芽胞桿菌為常見種群。陳倩倩等[9]從微生物發酵床豬舍空氣中，分離到特基拉芽胞桿菌。特基拉芽胞桿菌具有的這些生物活性，與其分泌的代謝物密切相關。目前，對特基拉芽胞桿菌功能物質的研究還較少。如官穎[16]篩選到1株能抑制水稻稻瘟病和促進水稻生長的特基拉芽孢桿菌GYLH-1，提取其活性物質分子量為 292.8，推斷該單一物質應該是一種未知的抗生素。陳倩倩[10]篩選了1株特基拉芽胞桿菌FJAT-14262，研究發現該菌能夠產生surfactin類脂肽。

本研究對特基拉芽胞桿菌FJAT-49377的代謝產物進行了測定，檢出成分包括了脂肽類、鞘脂類及衍生物、脂肪酸胺、抗生素及其組分、三肽等。結合文獻報道，特基拉芽胞桿菌FJAT-49377的活性成分主要包括五類：（1）表面活性素（surfactin），也稱“抗菌脂肽”具有抗細菌、病毒和支原體作用。王曉青[17]研究表明，surfactin能明顯抑制豬傳染性腸胃炎病毒（TGEV）。陳倩倩[10]篩選到1株產surfactin的特基拉芽胞桿菌FJAT-14262，對尖孢鐮刀菌具有明顯的抑菌活性;surfactin也應用在動物飼料，在飼料中添加surfactin可增強機體對脂肪的消化吸收，提高脂溶性維生素、類胡蘿卜素和微量元素的吸收等[18];也有研究表明，斷奶仔豬飼料中添加100 mg·kg-1水平的surfactin，可提高斷奶仔豬生長性能[19]，降低斷奶仔豬腹瀉率[19]，改善血液生化指標[19]，改善腸道健康狀況[20]，提高免疫功能[20]。（2）抗生素類，包括烏達霉素（Urdamycin）和雙效菌素（Zwittermicin A）。烏達霉素是具有抗腫瘤作用的昂環素類抗生素，如烏達霉素A是弗氏鏈霉菌Streptomyces fradiae的主要產物，具有一定抗癌活性。雙效菌素是由芽胞桿菌產生的廣譜氨基多元醇類抗生素[21]，對卵菌、藻類、原生生物和多種G-和G+細菌均表現出一定的抑菌活性[22]。（3）鞘氨醇類，是重要的生物標記物，部分具有抗癌[23]和抗腫瘤[24]活性。田鶴[25]研究表明植物鞘氨醇（Phytosphingosine）、二氫神經鞘氨醇（C16 Sphinganine）等為奶牛熱應激診斷相關的可能生物標記物。高航[26]研究表明環境溫度主要引起了生長豬脂肪代謝、碳水化合物和氨基酸的變化，其中涉及脂肪酸變化的小分子物質主要包括植物鞘氨醇、花生四烯酸、鞘磷脂等。李巖等[27]研究添加酵母菌對飼喂不同精粗比日糧肉牛血漿代謝組的影響，結果表明，當精粗比為30∶70時，酵母添加組的生物標志物為神經鞘氨醇、鞘氨醇和卵磷脂 （18∶0）。Enigmol是一種鞘氨醇堿類似物，具有潛在的抗癌活性，并被證實比使用結腸癌細胞系HT29細胞的天然鞘氨醇堿具有更高的細胞毒性和持久性[23]，也有實驗證明，Enigmol在體外預防或逆轉了不同階段的小鼠卵巢表面上皮（MOSE）細胞的腫瘤進展[28]。（4）三肽化合物，與豬的營養密切相關，豬在腸道內對蛋白質的利用大部分是以三肽和二肽形式吸收的[29];另外，三肽對預防和治療仔豬腹瀉有一定的作用[28]。（5）其他化合物，如2，6二氨基7

羥基壬二酸：是抗菌肽伊短菌素Edeine B[30]、Edeine D[31]、Edeine F[32]的組分;而咪菌腈[2苯基2正丁基3（1H咪唑1）丙腈]，具有廣譜內吸性殺菌活性，對于一些重要的禾谷類和園藝作物上多種難治真菌病害具有內吸殺菌活性[33];胍基前克拉維胺（Guanidinoproclavaminic acid）：與克拉維酸（Clavulanic acid，CA）的生物合成相關，能通過環化和脫氫生成克拉維酸，而克拉維酸是一種強大的不可逆β-內酰胺酶抑制劑[34]，如與阿莫西林同時應用時使得通過產生 β-內酰胺酶對阿莫西林耐藥的大多數細菌重新成為敏感菌[35]，唐一鳴[36]測定大腸桿菌對21種抗菌藥物的耐藥性，結果表明，大腸桿菌對頭孢噻肟/克拉維酸敏感性較高。

微生物發酵養豬的核心技術是利用其形成的有益功能微生物種群，長期和持續穩定地將豬糞尿進行降解。因此，以發酵床微生物為研究對象，特別是發酵床常見的微生物類群，研究其多樣性與分布特性，分析其代謝產物，對于揭示發酵床對豬糞污降解、物質轉化規律等具有重要意義。本研究以養豬發酵床中原位分離的特基拉芽胞桿菌FJAT-49377為研究對象，結合文獻檢索，對獲得的代謝產物進行討論，菌株代謝物中的表面活性素（surfactin）、烏達霉素（Urdamycin）、雙效菌素（Zwittermicin A）等，具有細菌、病毒等活性;表面活性素（surfactin），可以提高動物的生長性能[19]，改善腸道健康[20]，提高免疫功能[20]的活性;三肽化合物，與豬的營養密切相關，影響豬對蛋白質的利用。而胍基前克拉維胺是重要β-內酰胺酶抑制劑克拉維酸的前體。發酵床原位分離的芽胞桿菌，其代謝產物中包含了豐富的生物活性物質，有待進一步的開發和利用。本研究為進一步詮釋發酵床原生菌對發酵床的作用機制提供理論依據，也為該活性菌株的開發與利用提供數據支持。而采用不同樣本處理方式與檢測方法來發掘活性物質，驗證功能成分在發酵床中所起的作用，進一步明確物質轉化和能量代謝的過程，還有待進一步研究。

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（責任編輯：柯文輝）

收稿日期：2021-11-05

作者簡介：陳崢，男，1982年生，博士，助理研究員，主要從事微生物代謝物及功能研究。

通信作者：劉波，男，1957年生，博士，研究員，主要從事微生物生物技術與農業生物藥物研究（E-mail：fzliubo@163.com）。

基金項目：福建省自然科學基金項目（2018J01036）;福建省農業科學院青年創新團隊項目（CXTD2021010-3）。