大蒜素改善腦出血大鼠神經功能的機制研究

李永召

腦出血是指非外傷腦實質內血管破裂所引發的出血，是神經系統領域內常見的疾病之一，具有較高的發病率和致死率[1,2]。腦出血后，出血灶周圍組織缺血、缺氧，造成炎性因子和多種因子大量釋放，腦水腫、氧化應激等連鎖反應引起腦組織繼發性損害，使腦出血患者的神經細胞功能嚴重受損[3,4]。有研究表明，腦出血后受損的神經元軸突有一定的再生與修復能力[5]，此研究對臨床中腦出血患者神經功能的恢復提供了新的治療靶點[6]。大蒜素是從蔥科蔥屬植物大蒜中提取的一種有機硫化合物，臨床上用于深部真菌和細菌感染及隱球菌性腦膜炎和肺結核的治療[7]，大蒜素同時具有消炎[8]、降血脂、降血壓、降血糖[9]及抗心律失常的藥理作用。大蒜素能改善腦缺血再灌注損傷，但有關大蒜素對腦出血損傷的研究筆者所見尚不多。本實驗通過膠原酶法制備腦出血大鼠模型，觀察大蒜素對腦出血大鼠神經功能的作用，并探討其促進腦出血后軸突再生的影響，從而為大蒜素的臨床用藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:雄性SD大鼠60只，SPF級，體重180～200 g，年齡6～8周，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0011。

1.1.2 藥物與試劑:大蒜素(西安天瑞生物技術有限公司，批號：201933282)；大鼠神經絲蛋白200(NF200)小鼠單克隆抗體(Merck公司，批號：N5389)、微管相關蛋白-2(MAP-2)兔多克隆抗體(Abcam公司，批號：ab32454)、髓鞘堿性蛋白(MBP)兔多克隆抗體(Abcam公司，批號：ab40390)、生長相關蛋白(GAP43)兔多克隆抗體(Abcam公司，批號：ab11136)、腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)兔多克隆抗體(Abcam公司，批號：ab3760)、糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)小鼠單克隆抗體(Abcam公司，批號：ab93926)。

1.2 方法

1.2.1 采用膠原酶法制備腦出血大鼠模型：根據參考文獻[10]，實驗動物以10%水合氯醛腹腔麻醉，俯臥位固定在大鼠腦立體定向儀，皮膚消毒，暴露顱骨前囟點，在手術顯微下用牙科鉆鉆孔，用小號直紋鉗開約2 mm 直徑小顱窗，用微量進樣器向右側尾殼核處緩慢注入2 μl 0.5 U膠原酶，留針10 min后，緩慢退出，鉆孔用骨蠟封閉，逐層縫合后回籠飼養，室溫控制在25℃左右。假手術組大鼠注射0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 分組與給藥:60只SD大鼠按照隨機數字表法分為假手術組、模型組、大蒜素低、中、高劑量組(15、30、60 mg/kg)，每組12只。術后30 min進行腹腔注射給藥，假手術組和模型組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液，以上均以1 ml/100 g給藥。

1.2.3 神經功能評分:給藥24 h后按Zea Longa評分法測定行為學變化。根據Zea Longa 推薦的五級制評分，并稍作改進，對大鼠神經功能進行評分：0分：正常，無神經損傷癥狀；1 分：對側前爪部分屈曲或完全屈曲；2分：向偏癱側輕度轉圈；3 分：向偏癱側明顯轉圈；4 分：向偏癱側傾倒；5分：不能自發行走，意識喪失。

1.2.4 腦組織含水量:行為學結束后，麻醉大鼠，每組取6只大鼠，快速斷頭取腦組織，去掉嗅球、小腦和低位腦干后，分別稱量腦濕重，再置于烘箱中，70℃烘烤24 h至恒重，精確稱量干重，按如下公式計算腦組織含水量。腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.5 HE染色:每組取3只大鼠，腦組織取材，固定于甲醛，24 h 后做石蠟切片，常規HE染色，顯微鏡下觀察腦組織的病理變化。

1.2.6 Western-blot方法檢測大鼠腦組織蛋白表達水平:每組取3只大鼠，取大鼠腦出血灶周圍組織，至于液氮中保存。大鼠腦組織，用組織裂解液冰浴中，充分勻漿，離心，使用酶標儀檢測腦組織蛋白濃度。按照說明書配制聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白樣本變性分離，轉移至PVDF膜，將膜在脫脂奶粉溶液中孵育，加入NF200、MAP-2、MBP、GAP43、AMPKα、GSK-3β一抗或內參GAPDH進行抗原抗體結合(稀釋度：1∶500)，加入相應的二抗于搖床上充分孵育結合，洗膜后用X膠片采用化學發光方法進行曝光顯影，用蛋白分析軟件將X膠片掃描后的圖片灰度值進行分析，以內參灰度值校正，以NF200、MAP-2、MBP、GAP43、AMPKα、GSK-3β/GAPDH灰度值比值代表目的蛋白相對表達水平。

2 結果

2.1 大蒜素對腦出血大鼠神經功能評分的影響 與假手術組比較，模型組神經功能評分明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，大蒜素低、中、高劑組神經功能評分明顯降低(P<0.05或<0.01)。見表1。

表1 5組大鼠神經功能評分比較 n=12,分,

2.2 大蒜素對腦出血大鼠腦含水量的影響 與假手術組比較，模型組腦含水量明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，大蒜素低、中、高劑組腦含水量明顯降低(P<0.01)。見表2。

表2 5組大鼠腦含水量比較

2.3 大蒜素對腦出血大鼠病理損傷的影響 假手術組大鼠腦組織光鏡下可見，神經細胞排列有序、細胞核呈橢圓形，核大，均勻規則；模型組可見細胞排列紊亂，水腫明顯，細胞核固縮；大蒜素組病理損傷比模型組明顯減輕。見圖1。

假手術組 模型組 大蒜素低劑量組 大蒜素中劑量組 大蒜素高劑量組

2.4 大蒜素對腦出血大鼠NF200、MAP-2、MBP、GAP43表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織NF200、MAP-2、MBP、GAP43蛋白表達下降(P<0.01)；與模型組比較，大蒜素低劑組 MAP-2、MBP、GAP43表達上升(P<0.05或<0.01)，大蒜素中、高劑組NF200、MAP-2、MBP、GAP43蛋白表達上升(P<0.05或<0.01)。見表3，圖2。

表3 5組大鼠腦組織NF200、MAP-2、MBP、GAP43蛋白表達的變化

圖2 5組大鼠腦組織NF200、MAP-2、MBP、GAP43蛋白表達的Western-blot檢測；1 假手術組；2 模型組；3 大蒜素低劑量組；4 大蒜素中劑量組；5 大蒜素高劑量組

2.5 大蒜素對腦出血大鼠AMPKα、GSK-3β表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織AMPKα、GSK-3β蛋白表達上升(P<0.01)；與模型組比較，大蒜素低劑組GSK-3β蛋白表達下降(P<0.05)，大蒜素中、高劑組AMPKα、GSK-3β蛋白表達下降(P<0.01)。見表4，圖3。

圖3 5組大鼠腦組織AMPKα、GSK-3β表達的Western-blot檢測；1 假手術組；2 模型組；3 大蒜素低劑量組；4 大蒜素中劑量組；5 大蒜素高劑量組

表4 5組大鼠腦組織AMPKα、GSK-3β蛋白表達變化

3 討論

大蒜素是一種廣譜抗菌藥，臨床上主要用于深部真菌和細菌感染，同時大蒜素具有降血壓、降血脂、抗腫瘤、抗氧化及提高免疫力等多種生物學功能。大蒜素對腦損傷的實驗研究也有大量報道，Shao等[11]報道了大蒜素能夠減輕腦水腫、抑制氧化應激損傷和細胞凋亡，改善實驗性蛛網膜下腔出血大鼠神經功能；李春艷等[12]報道了大蒜素能夠抑制大鼠局灶性腦缺血再灌注后的血液流變學改變，對腦缺血損傷大鼠具有良好的保護作用。本研究采用膠原酶法制備腦出血大鼠模型，我們觀察到腦出血大鼠神經功能評分明顯升高，神經功能嚴重受損，腦水腫含量亦明顯升高，給予大蒜素干預后，神經功能評分和腦含水量明顯降低，同時HE染色也顯示了大蒜素能改善腦出血大鼠腦組織的病理損傷，表明大蒜素能夠減輕腦水腫，改善神經功能，對腦出血大鼠有很好的保護作用。

大腦神經元在死亡后幾乎無法再生，但已有報道神經元軸突有一定的再生與修復能力，可幫助腦出血患者的神經功能得到一定的恢復[13]。目前研究最多的神經元軸突相關蛋白有神經絲蛋白NF200、微管相關蛋白MAP-2、髓鞘堿性蛋白MBP等[14,15]。NF200是構成神經細胞軸突中間絲的蛋白質，可以反映軸突的生長情況，是神經元軸突標記物，與微管和微絲一起形成神經元細胞骨架[16]；MAP-2是微管相關蛋白，與NF200共同參與細胞骨架形成及軸突發生，影響神經傳導速度[17]；MBP是神經系統少突細胞和周圍神經系統雪旺細胞合成的一種強堿性膜蛋白，是判斷中樞神經系統破壞程度的重要指標[18]；GAP43蛋白與神經元軸突的生長以及突觸可塑性密切相關[19,20]。本研究觀察到腦出血大鼠出血部位NF200、MAP-2、MBP和GAP43蛋白表達明顯降低，給予大蒜素治療后，能顯著提高NF200、MAP-2、MBP和GAP43蛋白表達，表明大蒜素能夠促進腦出血后軸突再生。

為進一步研究大蒜素對腦出血后軸突再生的機制，我們對AMPK/GSK-3β信號通路進行了檢測。AMPK是調節生物能量代謝的重要分子，是代謝研究中的核心因子參與腦細胞的代謝。GSK-3β作為信號蛋白和轉錄因子，調節細胞的分化、增殖、存活和凋亡，已有研究報道了降低GSK-3β活性可調控細胞骨架，促進微管穩定性，增加軸突的再生[21]。本研究結果顯示腦出血后AMPK和GSK-3β表達下降，AMPK/GSK-3β信號通路下調，大蒜素能明顯上調AMPK/GSK-3β通路，結合上述的軸突再生相關蛋白NF200、MAP-2、MBP和GAP43表達上升，表明大蒜素干預后，可以降低腦組織AMPK水平，抑制神經元GSK-3β活性，提高軸突再生相關蛋白表達，促進軸突再生，改善腦出血大鼠神經功能，發揮其腦組織保護的作用。