鉀通道在HIV膜蛋白gp120致神經性疼痛中的作用及機制

鄭凡艷，鄧彩云，張 力，陳 芳，王文娟

(貴州醫科大學環境污染與疾病監控教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的一種破壞人體免疫系統的獲得性免疫缺陷綜合癥。HIV感染后其外殼膜上的糖蛋白gp120可致中樞神經敏化，進而引起運動、感覺的失調，產生神經病理性疼痛等一系列嚴重的外周神經病變。近年來，HIV致神經性疼痛的發病率越來越高，HIV的病人可呈現不同程度的疼痛，這種頑固性疼痛目前亦無特效治療藥物[1]。此外，目前對于HIV相關的神經病理性疼痛的發病機制尚不明確，近年來發現離子通道在gp120直接興奮初級傳入神經元而導致痛覺過敏的過程中起著關鍵作用。其中，在疼痛發生、發展和傳遞過程中，電壓門控性鉀離子通道(Kv)發揮著重要的作用。本研究采用gp120作用于大鼠坐骨神經[2]，建立大鼠神經病理性疼痛模型，檢測外向型鉀離子通道Kv2.1、Kv4.2的蛋白表達情況，探討鉀通道在HIV致神經性疼痛中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 健康、清潔級SD雄性大鼠16只，由貴州醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SYXK(黔)2012-0001。包膜糖蛋白gp120、兔多克隆抗體Kv2.1、兔多克隆抗體Kv4.2、山羊抗兔IgG-HRG購自abcam公司，兔β-Actin抗體、彩虹180廣譜蛋白Marker、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶公司，RIPA裂解液(強)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、Western一抗、抗稀釋液(碧云天生物技術公司)，HRP化學發光試劑盒、PVDF膜(美國Millipore公司)。

1.2 動物分組及大鼠gp120模型建立

1.2.1 動物分組 雄性SD大鼠均為健康、清潔級，體重為225～250 g，適應性喂養1周，隨機數字表法將其分為gp120模型組和對照組，每組8只大鼠。大鼠的飼養條件為12 h明/暗循環，室溫(21±1)℃，自由飲食和攝取水。

1.2.2 大鼠gp120模型建立戊巴比妥鈉麻醉雄性SD大鼠，切開大鼠左腿側彎凹陷皮膚，使坐骨神經暴露。實驗組采用2 mm×6 mm氧化纖維素膜浸泡于250 μl濃度為0.1%大鼠血清白蛋白(RSA)生理鹽水溶液中，其中含有100 mg gp120，對照組則放于不含gp120濃度為0.1%的大鼠血清白蛋白生理鹽水中處理。大鼠血清白蛋白處理后的纖維素膜，纏繞與大鼠坐骨神經分叉部位且不要壓迫神經。此外，若對照組大鼠術后存在任何的神經功能障礙，則剔除該實驗中。

1.3 Western-blot 大鼠麻醉后，急性分離DRG神經元，勻漿裂解離心提取相關蛋白后，﹣20℃冰箱保存。10%SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，每孔上樣20 g，轉PVDF膜，BSA封閉2 h，一抗孵育過夜(4℃)，二抗孵育2 h(室溫)。Bio-Rad ChemiDocTMXRS+化學發光成像系統采集圖像，采用Image Lab軟件分析蛋白條帶，以目的條帶與各自內參β-action的灰度比值反映目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 Kv2.1蛋白表達 在大鼠術后14 d后，麻醉大鼠，急性分離DRG，提取相關蛋白。Western-blot結果顯示，與對照組相比，gp120模型組Kv2.1蛋白濃度表達水平略降低，t=4，P>0.05。見圖1。

2.2 Kv4.2蛋白表達 大鼠術后14 d，麻醉大鼠，分離DRG，提取相關蛋白。Western-blot結果顯示，gp120模型組Kv4.2蛋白濃度表達水平明顯低于對照組，t=69，P<0.05。見圖1。

3 討論

神經元超微結構的改變或者破壞是引起神經病理性疼痛的主要機制之一，HIV病毒通過其外殼表面膜上的糖蛋白gp120與免疫細胞上的CD4糖蛋白、趨化因子共受體結合在一起進入細胞內[3-4]。在外周神經系統的背根神經節神經元(DRG)，gp120可直接入侵繼而引發神經元發生變性，影響神經元的超微結構或活性活性。研究表明[5]，gp120體外實驗具有神經毒性，外周或者中樞施用gp120足以引發疼痛。傷害感受器在接收到外界刺激后，引起初級傳入神經末梢興奮，細胞膜去極化形成的向中樞神經系統傳遞電流(動作電位)而形成人類的痛覺。簡單的說，位于傷害感受器上離子通道和特定的分子的共同作用，產生了疼痛的感覺。

Kv是廣泛分布的的一類電壓門控性離子型通道，神經元動作電位產生和傳播是其活化的結果，在疼痛發生及傳遞過程中發揮著重要的作用。Kv2.1、Kv4.2分別是外向延遲整流鉀通道(TEA 敏感型)和瞬時外向鉀通道(4-AP 敏感型)的主要成分，均存在于DRG神經元中[6-7]。有研究表明[8]，β淀粉樣蛋白片段可作用于瞬時外向鉀通道Kv4.2，使其表達上調，引起外向電流的增大。本研究結果表明，與對照組相比，gp120模型組大鼠Kv4.2的蛋白表達明顯降低，提示Kv4.2可能參與gp120所致的HIV相關病理性疼痛過程的發生。本研究未發現gp120模型組大鼠Kv2.1的蛋白表達發生改變，提示Kv2.1可能不參與該過程。綜上所述，Kv4.2可能參與gp120所致的神經病理性疼痛，其具體分子機制尚需進一步研究。