熒光PCR探針熔解曲線法與微孔板法檢測MTB耐藥性的臨床應(yīng)用比較

王佩 趙國連 雷倩 鄭丹 崔曉利 周俊

近幾年，我國結(jié)核病的發(fā)病率逐年下降，但是耐藥結(jié)核病患者逐年增多，且治療難度大，醫(yī)療費用高，給結(jié)核病的防控帶來了巨大的挑戰(zhàn)。快速而準(zhǔn)確地掌握患者的耐藥情況是治療和控制耐藥結(jié)核病傳播的重要手段。目前，表型藥物敏感性試驗(簡稱“表型藥敏試驗”)仍是診斷結(jié)核分枝桿菌(MTB)耐藥性的主要方法，但是表型藥敏試驗必須使用培養(yǎng)后分離的菌株，而且受到培養(yǎng)基上MTB生長速度的限制，一般需要28～42 d才能獲得樣品相關(guān)耐藥性的結(jié)果。這使得患者不能及時得到有針對性的治療，還增加了耐藥MTB傳播的風(fēng)險。分子生物學(xué)檢測方法能夠快速檢測MTB的耐藥性，但檢測的準(zhǔn)確性尚需大量臨床數(shù)據(jù)來驗證。微孔板法[最低抑菌濃度(MIC)法]是在液體培養(yǎng)基礎(chǔ)上建立的一種表型藥敏試驗方法，與傳統(tǒng)的固體藥敏試驗相比能提供更詳細(xì)的耐藥信息，且大大縮短了試驗周期[1-2]。筆者通過分析熒光PCR探針熔解曲線法和微孔板法檢測MTB耐藥性的一致性，研究MTB基因突變和MIC的關(guān)系，并探討這兩種方法在臨床中的應(yīng)用價值。

資料和方法

一、研究對象

搜集2019年1—12月分離自西安市胸科醫(yī)院就診患者并經(jīng)鑒定確認(rèn)的343株MTB臨床分離株，患者標(biāo)本包括痰液、肺泡灌洗液、胸腹腔積液、膿液、活體組織、腦脊液、引流液、尿液、胃液；菌株均進行了微孔板法藥敏試驗和熒光PCR探針熔解曲線法檢測。

二、細(xì)菌培養(yǎng)及菌種鑒定

將合格的標(biāo)本用BACTEC MGIT 960系統(tǒng)(美國BD公司)進行分枝桿菌液體培養(yǎng)，對培養(yǎng)陽性的菌液進行萋-尼抗酸染色法涂片鏡檢，確認(rèn)為分枝桿菌的液體培養(yǎng)標(biāo)本用膠體金標(biāo)記的MPB64蛋白單克隆抗體試劑(杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司)進行MTB快速抗原檢測，鑒定為MTB的菌株納入研究，并進行后續(xù)藥敏試驗。

三、微孔板法表型藥敏試驗

應(yīng)用珠海銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司生產(chǎn)的試劑盒(批號：2005041ZJSPJ)。在雜菌抑制劑中加入無菌稀釋液，充分搖勻后取100 μl 加入藥敏培養(yǎng)基并搖勻。在96孔板的A1/E1和B1/F1孔中加入180 μl的藥敏培養(yǎng)基，分別作為1/10和1/100的參照孔。在C1/D1或G1/F1孔加入200 μl藥敏培養(yǎng)基作為陰性對照孔。把培養(yǎng)陽性的待測菌株在YK-50多通道混勻器(珠海銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司)中磨菌至比濁濃度1 mg/ml，取100 μl加入藥敏培養(yǎng)基中，混勻后取200 μl加入每一孔，其中陰性對照孔中不加，1/10參照孔中加20 μl，從1/10孔中取20 μl加入1/100參照孔。為了保證結(jié)果可靠，每批樣品中除陰性對照外，另設(shè)MTB標(biāo)準(zhǔn)減毒株(H37Ra；菌株編號：ATCC25277，中國藥品生物制品檢定所)配制的陽性對照(A2/B2或E2/F2孔)進行質(zhì)量控制。本實驗主要參考異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇、莫西沙星和左氧氟沙星等6種抗結(jié)核藥品的藥敏試驗結(jié)果。

將96孔藥敏板密封好放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察結(jié)果(采用YK-909TB藥敏閱讀儀)，孔底出現(xiàn)直徑2 mm致密菌圈判斷為陽性，生長欠佳者放入培養(yǎng)箱繼續(xù)觀察培養(yǎng)，在第10、14、21天時若有菌體沉淀則為陽性，培養(yǎng)21 d均無菌體沉淀者報告為陰性。

四、熒光PCR探針熔解曲線法

待測樣品加入等量4%氫氧化鈉溶液進行液化，之后經(jīng)過2次離心(13 000×g，5 min)及清洗，加入50 μl核酸提取液并充分渦旋，用Ectractor TM 34快速核酸提取儀(北京博奧生物有限公司)振蕩，最后在95 ℃金屬浴中放置5 min再離心(13 000×g，1 min)。將2 μl提取好的核酸加入擴增反應(yīng)液，放入ABI 7500熒光定量PCR儀，擴增程序：37 ℃、300 s(循環(huán)1次)，94 ℃、180 s(循環(huán)1次)，94 ℃、15 s(循環(huán)40次)，60 ℃、30 s(循環(huán)40次)，50 ℃、10 s(循環(huán)1次)。最后FAM通道的循環(huán)閾值(Ct值)<40時判斷為MTB陽性；如果FAM通道的Ct值≥40則判斷為MTB陰性；其中，F(xiàn)AM通道的Ct值≥40，且HEX通道Ct值<40為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)，陰性和NTM需要排除。Ct值越低含菌量越高，F(xiàn)AM通道的Ct值<30時可以用剩余的核酸提取物進行熒光PCR探針熔解曲線法耐藥檢測。

分別將異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇，以及氟喹諾酮類藥品耐藥檢測試劑盒(廈門致善生物科技股份有限公司，批號：20031801)平衡至室溫溶解。將核酸提取物5 μl加入包含PCR混合液(包括引物、探針和脫氧核糖核苷三磷酸)和酶混合液(包括耐熱DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶)的八聯(lián)管中，放入實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(廈門致善生物科技股份有限公司)進行檢測，陽性對照為含有相應(yīng)野生型擴增靶基因的質(zhì)粒。反應(yīng)檢測程序參照說明書。待測樣品和陽性對照之間的熔解曲線熔點差異(Tm)如果≤1 ℃判斷為野生型，Tm≥2 ℃則判斷為突變，Tm值介于1～2 ℃則為耐藥性不明確。突變位點包括6種藥品相關(guān)的17個位點。如果熒光PCR探針熔解曲線耐藥檢測中，同時檢出了突變峰和野生峰，則報告耐藥，同時備注為異質(zhì)性耐藥。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，以微孔板法藥敏試驗結(jié)果作為參照標(biāo)準(zhǔn)，評價熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTB對4種一線抗結(jié)核藥品及2種氟喹諾酮類抗結(jié)核藥品耐藥的效能，計算公式：敏感度(%)=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度(%)=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值(%)=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值(%)=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；約登指數(shù)=敏感度+特異度-1。陽性似然比=敏感度/(1-特異度)，陰性似然比=(1-敏感度)/特異度。陽性似然比越大，陰性似然比越小表示檢測方法越準(zhǔn)確。一致性用Kappa檢驗，Kappa值>0.80時認(rèn)為一致性非常好，Kappa值為0.61～0.80時認(rèn)為一致性較好，Kappa值為0.41～0.60時認(rèn)為一致性一般，Kappa值<0.41時認(rèn)為一致性較差。

結(jié) 果

一、耐藥性檢測

微孔板法檢測343株MTB藥敏試驗結(jié)果顯示，對6種抗結(jié)核藥品敏感有228株(66.47%)，對任一藥品耐藥有115株(33.53%)；其中，耐多藥有43株(12.54%)。熒光PCR探針熔解曲線法檢測343株MTB中，共331株MTB檢出了明確耐藥基因，其他12株有部分耐藥基因的耐藥性不明確，包括10株異煙肼耐藥性不明確，1株利福平耐藥性不明確，1株鏈霉素耐藥性不明確，4株乙胺丁醇耐藥性不明確。213株(64.35%)菌株對6種抗結(jié)核藥品耐藥基因檢測均為野生型，118株(35.65%)有1個或多個基因檢測為突變型；其中，異煙肼和利福平耐藥基因同時發(fā)生突變者有53株(16.01%)。

以微孔板法藥敏試驗結(jié)果為參照，熒光PCR探針熔解曲線法檢測利福平、異煙肼、鏈霉素、莫西沙星和左氧氟沙星的敏感度和特異度均>91.00%，約登指數(shù)均>0.88，Kappa值均>0.75；對6種藥品耐藥性檢測陰性預(yù)測值均高于98.00%，對左氧氟沙星耐藥檢測的陽性預(yù)測值最高，其次為異煙肼、鏈霉素、利福平和莫西沙星，對乙胺丁醇耐藥性檢測的陽性預(yù)測值最低(表1)。

二、MTB基因突變與表型藥敏試驗MIC的相關(guān)性

1.異煙肼：熒光PCR探針熔解曲線法檢測的343株MTB中，有10株耐藥性不明確。333株檢測結(jié)果有效的MTB中有88株(26.43%)發(fā)生突變，單一位點突變者占94.32%(83/88)。單一位點突變率最高的是KatG315密碼子(75.00%，66/88)，此位點發(fā)生突變的菌株表型藥敏試驗?zāi)退幝室沧罡?92.42%，61/66)，而且以MIC值為1.6 μg/ml 的高濃度耐藥為主。發(fā)生KatG315密碼子突變的異質(zhì)性耐藥的5株MTB的表型藥敏試驗結(jié)果均為耐藥。未發(fā)現(xiàn)inhA94密碼子單獨突變的菌株。發(fā)生多位點突變的5株MTB表型藥敏試驗結(jié)果均為耐藥，且均為高濃度耐藥。5株MTB發(fā)生AhpC啟動子區(qū)(-44～-30及-15～3位點)突變，4株表型藥敏試驗結(jié)果為敏感，包括1株異質(zhì)性耐藥菌株(表2)。

2.利福平：熒光PCR探針熔解曲線法檢測的343株MTB中，1株耐藥性不明確。342株檢測結(jié)果有效的MTB中有60株(17.54%)發(fā)生突變，單一位點突變占91.67%(55/60)。發(fā)生rpoB基因529～533位密碼子突變的菌株最多(65.00%，39/60)，此位點發(fā)生突變的菌株表型藥敏試驗?zāi)退幝室沧罡?92.31%，36/39)。發(fā)生rpoB基因507～512位密碼子突變的菌株表型藥敏試驗?zāi)退幝首畹?1/5)，而且在與rpoB基因521～528位密碼子或rpoB基因529～533位密碼子同時發(fā)生突變時，表型藥敏試驗結(jié)果也均為敏感。2株MTB發(fā)生rpoB基因513～520位密碼子突變，1株表型藥敏試驗結(jié)果為耐藥；另外1株異質(zhì)性耐藥菌株表型藥敏試驗結(jié)果為敏感(表3)。

表2 熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTB對異煙肼耐藥基因突變與表型藥敏試驗MIC值相關(guān)性

表3 熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTB對利福平耐藥基因突變與表型藥敏試驗MIC值相關(guān)性

3.鏈霉素：熒光PCR探針熔解曲線法檢測的343株MTB中，1株耐藥性不明確。342株檢測結(jié)果有效的MTB中有76株(22.22%)發(fā)生突變，單一位點突變占98.68%(75/76)。發(fā)生rpsL基因43位密碼子突變的菌株最多(61.84%，47/76)；8株發(fā)生rpsL基因88位密碼子突變的菌株表型藥敏試驗結(jié)果均為耐藥。發(fā)生rrs基因905～908位點突變的菌株表型藥敏試驗?zāi)退幝首畹?1/10)，該位點有5株MTB為異質(zhì)性耐藥，其中4株表型藥敏試驗結(jié)果為敏感，1株為耐藥。發(fā)生rrs基因513～517位點突變的菌株中有1株為異質(zhì)性耐藥，表型藥敏試驗結(jié)果為中度敏感(表4)。

4.乙胺丁醇：熒光PCR探針熔解曲線法檢測的343株MTB中，有4株耐藥性不明確。339株檢測結(jié)果有效的菌株中有29株(8.55%)發(fā)生突變，均為單一位點突變。發(fā)生embB基因306位密碼子突變的菌株比例最高(65.52%，19/29)。1株MTB發(fā)生embB基因378位密碼子突變，且表型藥敏試驗結(jié)果為敏感。發(fā)生embB基因406位密碼子和306位密碼子突變的菌株表型藥敏試驗?zāi)退幝室草^低(表5)。

表4 熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTB對鏈霉素耐藥基因突變與表型藥敏試驗MIC值相關(guān)性

表5 熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTB對乙胺丁醇耐藥基因突變與表型藥敏試驗MIC值相關(guān)性

5.氟喹諾酮類藥品：熒光PCR探針熔解曲線法檢測的343株MTB中，33株(9.62%)發(fā)生gyrA基因88～94位密碼子突變。表型藥敏試驗結(jié)果顯示，31株(93.94%，31/33)對左氧氟沙星耐藥(MIC為8 μg/ml)，24株(72.73%，24/33)對莫西沙星耐藥(MIC為2 μg/ml)。熒光PCR探針熔解曲線檢測到2株菌株為異質(zhì)性耐藥，表型藥敏試驗均對莫西沙星敏感；1株對左氧氟沙星耐藥，1株敏感。

討 論

本研究顯示，以表型藥敏試驗結(jié)果為參考，熒光PCR探針熔解曲線法對6種抗結(jié)核藥品耐藥性檢測的敏感度和特異度均高于90%。除乙胺丁醇外，異煙肼、鏈霉素、左氧氟沙星、利福平、乙胺丁醇、莫西沙星的Kappa值均≥0.75，說明這兩種檢測方法有較好的一致性。另外，對6種藥品耐藥性檢測的約登指數(shù)均≥0.88，說明熒光PCR探針熔解曲線法的真實性較好。此外，熒光PCR探針熔解曲線法可以直接對多種類型的臨床標(biāo)本直接檢測，操作簡便，檢測時間比表型藥敏試驗大大縮短，還對同時含有敏感菌和耐藥菌的復(fù)合菌群具有良好的分辨能力[3-4]。所以，基于分子生物學(xué)的快速耐藥基因檢測方法可以為結(jié)核病，尤其是耐藥結(jié)核病的早診斷和早治療提供有力的支持。

本研究結(jié)果顯示，熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTB對一線抗結(jié)核藥品的敏感度均較高，顯示該方法對這4種藥品的MTB耐藥相關(guān)基因位點覆蓋率較高；且表型藥敏試驗?zāi)退幍木曛写蟛糠峙c所檢測的位點突變有相關(guān)性，這與許多研究一致[5]。熒光PCR探針熔解曲線法檢測MTB對氟喹諾酮類藥品耐藥性的敏感度較低，尤其是檢測MTB對左氧氟沙星耐藥的敏感度僅為91.18%，雖然在可接受范圍內(nèi)，但是仍低于Chakravorty等[6]和張志國等[7]研究結(jié)果，原因可能是熒光PCR探針熔解曲線法只覆蓋了gyrA基因但未檢測gyrB基因。另外，本研究顯示，莫西沙星和左氧氟沙星的陽性預(yù)測值有明顯的差異，提示MTB對這2種藥品的相關(guān)耐藥基因可能不完全相同，尤其是莫西沙星可能存在其他機制來殺滅MTB。

本次研究發(fā)現(xiàn)，約50%的經(jīng)熒光PCR探針熔解曲線檢測為異質(zhì)性耐藥的菌株，其表型藥敏試驗結(jié)果為敏感。這可能是樣品中耐藥菌株比例較低引起的，也提示異質(zhì)性耐藥會導(dǎo)致2種檢測方法結(jié)果出現(xiàn)不一致。在實際檢測過程中要重視因異質(zhì)性耐藥引起的假陽性情況，尤其注意MTB耐鏈霉素的rrs基因905～908位點的突變。本研究通過對熒光PCR探針熔解曲線法和微孔板法表型藥敏試驗的比較，了解到熒光PCR探針熔解曲線法可以快速獲取患者的耐藥情況，尤其是未檢測到基因突變時，可以使用一線抗結(jié)核藥品方案。但是熒光PCR探針熔解曲線法對耐藥MTB的預(yù)測效率較低，如果檢測到突變基因，但表型藥敏試驗結(jié)果不一定會耐藥，或者有可能只是高濃度敏感，尤其是AhpC啟動子區(qū)(-44～-30和-15～3位點)，rpoB507～512位點和embB406位點突變時，最好等待表型藥敏試驗結(jié)果后，再考慮更換藥物治療方案。

MIC分析結(jié)果顯示，很多MTB基因突變也會導(dǎo)致其對抗結(jié)核藥品高濃度敏感及中度敏感的狀況。例如，rpoB521～528和529～533位點、rrs513～517和905～908位點、embB306和406位點，以及gyrA88～94位點的突變均會出現(xiàn)較大概率的表型藥敏試驗為高濃度敏感及中度敏感的結(jié)果。另外，本研究中，出現(xiàn)AhpC啟動子區(qū)(-44～-30及-15～3位點)、rpoB507～512位點、rrs905～908位點、embB378位點等突變的菌株表型藥敏試驗結(jié)果多為敏感，可能與基因表達(dá)不足有關(guān)[5,8]，具體的機制還需要進一步研究。

綜上所述，熒光PCR探針熔解曲線法可以利用患者臨床標(biāo)本快速檢測抗結(jié)核藥品的耐藥性，且方便快捷，但對部分耐藥靶點檢測結(jié)果與表型藥敏試驗結(jié)果存在不一致，且其能夠檢測的基因位點有限。因此，可以將兩種檢測方法綜合運用于結(jié)核病診療中，優(yōu)勢互補。對于普通初治患者和曾經(jīng)敏感的復(fù)治患者，早期可以用熒光PCR探針熔解曲線法檢測的陰性結(jié)果排除耐藥，待表型藥敏試驗結(jié)果明確后再進行調(diào)整治療方案。對于熒光PCR探針熔解曲線法檢測顯示為突變的患者，為了避免假陽性結(jié)果帶來的誤導(dǎo)，最好等待表型藥敏試驗結(jié)果復(fù)核。對于治療效果不好的初治患者和曾經(jīng)耐藥的復(fù)治患者則可以根據(jù)熒光PCR探針熔解曲線法檢測結(jié)果先進行經(jīng)驗性治療，再根據(jù)表型藥敏試驗結(jié)果調(diào)整方案。