分子生物學和液體培養方法提高綜合醫院結核病病原學診斷能力的價值

崔曉敬 魏棟 王春雷 曹彬

結核病的臨床表現缺乏特異性，甚至48.5%的患者無明顯臨床癥狀[1]。因此，病原學檢測是發現和確診肺結核的重要手段。但是，由于初診查痰率低、檢測手段落后、痰液質量差、痰涂片操作欠規范、分枝桿菌培養可及性低等原因[2]，我國肺結核的病原學診斷率較低。2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告顯示，我國肺結核病原學診斷比例僅為26.5%[3]，2020年WHO[4]報告中我國結核病患者病原學陽性比例為47%，而全球肺結核患者病原學陽性比例為57%。病原學陽性率低是造成肺結核診斷延遲的重要原因，而診斷延遲不僅可造成患者肺部結構不可逆性破壞，還會導致結核分枝桿菌(MTB)的持續傳播[5-6]。

目前，肺結核病原學診斷方法有痰抗酸染色、痰分枝桿菌培養、分子生物學檢測、病理學檢查等，標本類型除痰液外，還可送檢支氣管肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid，BALF)、活體組織等。分子生物學檢測是近年來被WHO認可并推薦的快速診斷方法，我國發布的《WS 288—2017肺結核診斷》也將其作為確診病例的診斷依據之一[7]。GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)是一種全自動半巢式實時熒光核酸擴增技術，可于2 h內完成檢測并出具報告[8]，2010年被WHO推薦用于結核病的快速診斷和利福平耐藥檢測[9]。分枝桿菌MGIT液體培養基培養法報告陽性結果時間(11 d)短于固體培養基培養法(22 d)，且檢出率相當[10-12]。

我國90%以上因癥就診肺結核患者首診于綜合醫院、基層醫療衛生機構或私人診所[3]。可見，綜合醫院是我國結核病患者發現的主戰場，也是結核病防治工作的第一道防線。運用現有檢測手段來切實提高我國各級綜合醫院肺結核病原學診斷能力需要開展系統性評估。為此，筆者總結對比了中日友好醫院引入GeneXpert和分枝桿菌MGIT液體培養法前后，肺結核患者發現和病原學診斷能力的變化，為進一步強化綜合醫院在我國結核病防控體系建設中的作用提供數據資料。

資料和方法

1.研究對象：從中日友好醫院病案系統中提取2014年3月至2018年12月全院各科室診斷為肺結核且上報傳染病卡的住院患者，篩選出院診斷前2位包括以下診斷的患者：原發性肺結核、亞急性血行播散性肺結核、急性血行播散性肺結核、空洞型肺結核、浸潤性肺結核、繼發性肺結核、支氣管結核、結核性胸膜炎等，不限年齡、性別、科室及是否有確定病原學證據。排除3個月內重復住院者和陳舊性肺結核患者，共納入1438例。對每例患者的診斷依據、病原學檢測方法及結果、病原學送檢時間及結果返回時間、入院時間及出院時間等進行查詢和登記。

2.病原學診斷：2014年3月至2016年12月本院僅開展抗酸染色和分枝桿菌固體培養；2017年1月起開展了GeneXpert檢測，同時用分枝桿菌液體培養取代了固體培養。送檢標本包括痰液、BALF、胸腔積液、活體組織等。所納入研究對象分別采用了不同的診斷方法或診斷方法組合。任意一種病原學檢測方法陽性即定義為病原學陽性，其余基于臨床癥狀、胸部影像學、診斷性治療等結果確診者為臨床診斷病例[4]。

抗酸染色為萋-尼染色法顯微鏡檢查，按《分枝桿菌分離培養標準化操作程序及質量保證手冊》進行；分枝桿菌固體培養基培養采用羅氏培養法(試劑盒購自瑞士羅氏公司)；分枝桿菌液體培養采用BACTEC MGIT 960分枝桿菌快速液體培養技術(簡稱“MGIT 960液體培養法”；試劑盒購自美國BD公司)；GeneXpert設備和試劑盒購自美國賽沛公司。

3.確診時間定義：綜合醫院患者確診為肺結核后即應辦理出院，轉診至結核病定點防治機構，因此，病原學陽性患者的確診時間定義為病原學陽性結果回報時間與入院時間之差；臨床診斷患者的確診時間為出院時間與入院時間之差(即住院時間)；出院后分枝桿菌培養回報陽性者以住院時間為確診時間。

4.統計學處理：采用SPSS 19.0軟件分析數據。計量資料為偏態分布，采用“中位數(四分位數)[M(Q1，Q3)]”表示，組間差異的比較采用Wilcoxon秩和檢驗；計數資料采用“構成比或率(%)”表示，組間差異的比較采用χ2檢驗；均以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.病原學陽性患者診斷情況：2014年本院肺結核患者病原學檢測陽性率僅為19.83%，2018年升至53.89%，見表1。分子生物學檢測及液體培養法開展前(2014—2016年)及開展后(2017—2018年)，肺結核患者病原學檢測陽性率分別為22.68%(132/582)和49.65%(425/856)，差異有統計學意義(χ2=106.184，P=0.000)。

2.耐藥結核病患者診斷情況：開展GeneXpert檢測后(2017—2018年)，本院經檢測確診的肺結核患者中利福平耐藥比例分別為11.51%(16/139)和5.06%(12/237)，合計為7.45%(28/376)。而在開展GeneXpert檢測前，本院無耐藥結核病診斷能力。

3.肺結核確診時間情況：開展分子生物學檢測和液體培養法后(2017—2018年)，856例肺結核患者確診時間為7.00(3.00，12.00) d；開展之前(2014—2016年)，582例肺結核患者確診時間為10.00(6.00，14.00) d；開展后確診時間明顯縮短，差異有統計學意義(Z=-7.815，P=0.000 )。

2017—2018年，856例肺結核患者中，MGIT 960液體培養和GeneXpert檢測同時陽性者198例(23.13%)，均陰性者461例(53.85%)，僅1項陽性者197例(23.01%)。217例肺結核患者MGIT 960液體培養陽性時間為患者入院后的18.43(13.62，23.68) d。

討 論

我國結核病防治體系有其獨特的特點，由綜合醫院發現和轉診，結核病防治機構及定點醫院治療、管理、督導[13]。然而，綜合醫院因不承擔結核病的治療和管理工作，其結核病發現能力亦出現“廢用性萎縮”[14]。在現有的結核病防治體系下，利用現實可及的技術手段，提高綜合醫院結核病發現能力是控制結核病疫情的關鍵。筆者對某大型三級甲等綜合醫院開展分子診斷技術及分枝桿菌液體培養技術前后的肺結核診斷能力進行比較，發現前述兩種技術手段的開展，使得該院肺結核診斷例數逐步上升，且病原學診斷比例明顯升高。目前，我國60%的區(縣)具備分子生物學檢測能力，但大部分并未開展該項檢測工作[2]，且分子生物學檢測的設備多投放在結核病防治機構而非綜合醫院。鼓勵綜合醫院開展MTB核酸檢測，將病原學診斷提前至綜合醫院，而非轉診至結核病防治機構后再重復送檢，有助于患者的早期發現，且無論從傳染病控制角度還是經濟學指標考量均有益。

MTB的傳統藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)對生物安全性要求較高，多數綜合醫療機構無條件開展，且此項檢測耗時較長。GeneXpert檢測降低了生物安全需求，可快速獲得利福平耐藥信息，且與傳統藥敏試驗結果一致性較高。本研究結果顯示，開展GeneXpert檢測后，本院具備了初步的快速耐藥結核病診斷能力，但GeneXpert僅能檢測利福平單耐藥情況。已有研究表明，通過DNA測序鑒定與耐藥相關的突變以預測MTB對一線抗結核藥品的敏感性和耐藥性，與分離菌株表型藥敏檢測結果一致性較高，總體準確率為89.5%[15]，對培養陽性物進行分子生物學耐藥性檢測有助于短時間內獲得準確的耐藥信息。GeneXpert檢測開展后，住院患者的肺結核診斷中位時間較前縮短3 d，這大大降低了肺結核患者在綜合醫院內滯留的時間，減少了MTB院內傳播的風險。分枝桿菌液體培養法較固體培養法分離陽性時間縮短，且分離陽性率不低于固體培養基。本研究中患者液體培養陽性中位時間為入院后第18.43 d，與文獻中分離陽性時間(11 d)有差距[10]，考慮與患者住院后多次留痰或支氣管肺泡灌洗液等標本，以及含病原體的高質量標本送檢時間較入院時間延遲有關。另外，分枝桿菌液體培養法與GeneXpert檢測可起到互補作用，增加患者病原學陽性診斷比例，且有助于非結核分枝桿菌的診斷。

表1 2014—2018年某綜合醫院肺結核患者病原學診斷情況

綜上所述，分子生物學檢測和液體培養法可提高綜合醫院肺結核診斷能力，縮短住院患者肺結核確診時間，降低MTB院內傳播風險，早期發現耐藥結核病患者以及時轉診至有條件的結核病防治機構或定點專科醫院。綜合醫院應積極開展MTB分子生物學檢測及液體培養技術，這將整體提升我國結核病防控能力。本研究為探索綜合醫院結核病診治能力提升措施提供了依據，為強化綜合醫院在我國新型結核病防控體系建設中的作用提供了數據參考。