GSK656與克拉霉素、阿奇霉素體外協同抗膿腫分枝桿菌的活性研究

郭海萍 陳磊 霍鳳敏 逄宇 李姍姍

由非結核分枝桿菌引起的感染已成為全球人類健康的重要威脅[1-3]。膿腫分枝桿菌(Mycobacteriumabscessus)是一種快速生長型的非結核分枝桿菌，可引起某些患有慢性肺部疾病患者的感染，導致囊性纖維化、支氣管擴張，以及軟組織、骨關節感染[4]，因為膿腫分枝桿菌主要存在于自然水域、自來水系統、土壤中，所以膿腫分枝桿菌的感染主要是通過環境暴露獲得的[5]。然而，一些研究表明，囊性纖維化患者感染的膿腫分枝桿菌可以在人與人之間傳播[6-7]，因此，公共衛生機構需密切關注以減少院內感染的發生。膿腫分枝桿菌對現有的大多數抗生素及經典的抗結核藥品具有天然耐藥性[8]，這種細菌引起的感染極難治療。目前指南推薦使用大環內酯類聯合氨基糖苷類或碳青霉烯類藥物治療膿腫分枝桿菌引起的肺部疾病[9]；而膿腫分枝桿菌對大環內酯類藥物的耐藥性被認為是患者治療效果不佳的重要因素之一[8]。鑒于膿腫分枝桿菌感染的化療選擇有限，迫切需要發現更多有前景的藥品。

最近，一種新合成的3-氨甲基-4-鹵代苯并惡唑類化合物中的一種新成員GSK656被開發用于治療耐多藥結核病(MDR-TB)，已進入臨床試驗階段[10]。其作用機制主要是針對結核分枝桿菌亮氨酰-tRNA合成酶，將tRNA的3′末端捕獲在亮氨酸的編輯位點，通過在藥品和tRNA之間形成非生成性的共價化合物，從而抑制亮氨酸化和蛋白質合成[11]。值得注意的是，筆者初步的研究數據表明，該藥物在體外對膿腫分枝桿菌有活性，抑制90%受試菌所需的最低抑菌濃度(MIC90)值為0.063 mg/L[12]。因此，GSK656與其他抗菌藥物特別是與大環內酯類藥物是否具有不同的協同作用，將為制定含GSK656的有效方案提供新的臨床依據。本研究旨在評估GSK656聯合大環內酯類藥物克拉霉素(clarithromycin，Clr)和阿奇霉素(azithromycin，Azm)對膿腫分枝桿菌的體外抗菌活性。

材料和方法

一、主要儀器與材料

1.儀器：細菌培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)、Milli-Q水純化系統(美國Millipro公司)、生物安全柜(新加坡ESCO公司)、高壓蒸汽滅菌鍋(美國致微公司)、漩渦振蕩器(WH-3；上海滬西分析儀器廠)、分析電子天平(德國 Sartorius 公司)。

2.材料及試劑：磨菌瓶(日本ASONE公司)、多孔移液器(德國 Eppendorf公司)、一次性無菌接種環、排槍、加樣槽、96孔板、離心管、中性羅氏培養基(L?wenstein-Jensen，L-J；珠海麗珠醫藥集團股份有限公司)、比濁瓶、5%吐溫-80、無菌生理鹽水、麥氏比濁管。

3.實驗藥品： Clr和Azm均購自美國Sigma-Aldrich公司，GSK656由上海瀚香生物科技有限公司合成純化。均用無菌純水溶解后并用無菌的0.22 μm濾膜(愛爾蘭默克密理博公司)過濾備用。

4.菌株來源：收集2016—2018年期間首都醫科大學附屬北京胸科醫院菌株庫保存的非結核分枝桿菌，共80株，包括膿腫分枝桿菌30株，堪薩斯分枝桿菌7株，胞內分枝桿菌37株，鳥分枝桿菌5株和偶發分枝桿菌1株；將30株膿腫分枝桿菌納入本研究。所有膿腫分枝桿菌臨床分離株及標準菌株(ATCC 19977)通過多位點序列分析，包括16S rRNA、hsp65、rpoB、16S-23SrRNA序列測定和分析比對鑒定菌株種類[13]。

二、實驗方法

本研究共檢測了Clr、Azm和GSK656等3種藥品對30株膿腫分枝桿菌的體外最低抑菌濃度(MIC)、抑制50%受試菌所需的最低抑菌濃度(MIC50)、抑制90%受試菌所需的最低抑菌濃度(MIC90)，MIC50和MIC90的大小反映的是藥物的體外抑菌活性，數值越小，代表體外的抑菌活性越好。

(一)MIC測定

1. 膿腫分枝桿菌菌懸液制備：將篩選出的30株膿腫分枝桿菌接種于中性羅氏培養基斜面上，于37 ℃溫箱培養3～7 d至長勢良好期。刮取適量菌落于含有1～2滴5%吐溫-80的磨菌瓶中，充分渦旋振蕩30 s使菌落分散，靜止15 min，加適量無菌生理鹽水比濁至0.5麥氏單位[約有1.5×108菌落形成單位(CFU)/ml]，用配備好的水解酪蛋白培養基(Mueller-Hinton，MH)稀釋200倍,得到濃度約為7.5×105CFU/ml的工作菌液。

2. 微量肉湯稀釋法測定MIC[14]：在96孔板中加入配備好的100 μl MH培養基，再將配置好并稀釋至實驗所需最高濃度4倍的藥物溶液100 μl加入96孔板第一列，依次倍比稀釋至實驗所需最小濃度的4倍，最后一列100 μl混合液棄去，并同時設置不含藥物只含菌液的陽性對照孔1組，不含菌液不含藥物的陰性對照孔1組，最后加入相對應的100 μl的工作菌液。培養條件：37 ℃培養5 d。每孔加入預先配制好的70 μl(20 μl阿爾瑪藍和50 μl 5%吐溫-80預混合液)顯色液， 37 ℃培養24 h。結果判讀：液體為紅色表明有菌落生長，液體為藍色表明無菌落生長，按照藥物濃度從低到高的順序，第一孔藍色所對應的藥物濃度為MIC。其中，膿腫分枝桿菌對Clr和Azm的耐藥性基線值為≥8 mg/L[15]。所有MIC測定均以膿腫分枝桿菌標準菌株(ATCC 19977)作為對照，所有實驗均重復3次。

(二)分級抑制濃度指數(FICI)

三、統計學處理

使用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析，分類資料采用例數(百分比)表示，采用卡方檢驗比較不同藥物組合之間聯合效應，以P<0.05為差異有統計學意義,多組間兩兩比較使用校正后α=0.0167。

結 果

一、MIC

30株膿腫分枝桿菌分離株各抗菌藥物的MIC值見表1。本研究中檢測的30株膿腫分枝桿菌中10.0%(3/30)的分離株對Clr具有耐藥性。對于Azm，膿腫分枝桿菌的MIC值范圍為0.125～64 mg/L。在30株菌株中，9株膿腫分枝桿菌的MIC值高于8 mg/L，表明膿腫分枝桿菌對Azm的耐藥率為30.0%(9/30)。此外，GSK656對膿腫分枝桿菌分離株的MIC50值和MIC90值分別為0.25 mg/L和2 mg/L。

二、 GSK656-Clr聯合與GSK656-Azm聯合時的體外活性比較

如表2所示，GSK656-Azm聯合在3株(10.0%)膿腫分枝桿菌分離株中觀察到協同作用，而在9株(30.0%)膿腫分枝桿菌分離株中發現拮抗作用。另外，GSK656-Clr聯合的結果如表3所示，30株分離株中有6株(20.0%)表現出協同作用，對GSK656-Clr聯合的拮抗作用僅存在于1株(3.3%)分離株中。GSK656-Clr聯合和GSK656-Azm聯合的聯合效應分布差異有統計學意義(χ2=8.010，P=0.018)，其中拮抗作用在GSK656-Azm聯合中更為常見(χ2=6.857，P=0.012)(表4)。

表1 30株膿腫分枝桿菌分離株MIC值分布情況

表2 GSK656-Azm聯合對30株膿腫分枝桿菌臨床分離株的MIC和FICI范圍

表3 GSK656-Clr聯合對30株膿腫分枝桿菌臨床分離株的MIC和FICI范圍

表4 GSK656-Clr組和GSK656-Azm組聯合效應分布情況

討 論

膿腫分枝桿菌引起的疾病被認為是一種治療較困難的疾病，因為它對多種抗生素具有天然的耐藥性[17]。目前的治療方案推薦以大環內酯類抗生素治療，而只有大約1/3的患者在多藥抗生素治療后取得了良好的結果[18]。鑒于目前的抗生素選擇效果不佳，亟需新的藥物或者藥物組合來治療因膿腫分枝桿菌感染所引起的疾病。

在本研究中，主要采用可檢測細菌是否耐藥的單藥體外藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)以及可檢測藥物相互作用的聯合藥敏試驗，單藥體外藥敏試驗結果可為臨床醫生選擇相對敏感的藥物治療膿腫分枝桿菌引起的疾病提供合理的參考依據；但是，由于諸如膿腫分枝桿菌引起的非結核分枝桿菌病多采用多藥聯合治療[19]，而單藥藥敏試驗往往容易忽略藥物間的相互作用；因此，為進一步研究GSK656對膿腫分枝桿菌的抗菌活性，將其與治療膿腫分枝桿菌肺病的核心藥物Clr和Azm聯合用藥試驗。聯合用藥治療除增加抗菌效能，減少治療時耐藥的發生情況外，還可探索新藥與現有藥物之間的協同作用，為臨床治療提供新的治療方案[20]。本研究數據顯示，GSK656在體外對膿腫分枝桿菌具有良好的活性。此外，GSK656與大環內酯類沒有交叉耐藥，并且對耐Clr的分離株有效，這表明該藥物的方案可以作為治療大環內酯耐藥的膿腫分枝桿菌感染的替代方案，但需要進一步的臨床試驗來驗證這一結果。

Azm和Clr作為治療膿腫分枝桿菌肺病的常規藥物，在體外藥敏試驗中，將其與GSK656聯合作用，可提供GSK656和常規抗膿腫分枝桿菌藥物之間療效的直接比較，并探討GSK656與Azm和Clr等大環內酯類抗菌藥物之間不同的協同作用，為GSK656在臨床的應用提供新的參考依據。本研究結果表明，GSK656-Azm聯合的拮抗效應比GSK656-Clr聯合的拮抗效應更為明顯。這與之前一項研究結果類似，即Azm和抗真菌藥物的組合比Clr的組合產生更高的拮抗抗真菌作用[21]。值得注意的是，GSK656-Azm聯合的拮抗作用主要是導致其與Azm聯合時MIC值增加的原因。雖然GKS656-Azm和GSK656-Clr對膿腫分枝桿菌的聯合作用模式不同的確切原因尚不清楚，但筆者的研究結果表明，與Azm相比，Clr更適合與GSK656共同制定有效的治療方案。由于協同作用而減少的MIC可能有助于取得良好的預后，從而提高臨床療效，減少耐藥的出現[22]。

總之，GSK656在體外對膿腫分枝桿菌具有良好的活性。GSK656-Azm的拮抗效應比GSK656-Clr的拮抗效應更多見。但需要進一步的臨床試驗來評估GSK656和含GSK656的聯合用藥在體內的療效。

本研究也有一些局限性。首先，體外確定的抗菌藥物的活性可能不能預測體內的藥效，特別是協同作用，而且由于選取的膿腫分枝桿菌數量較少，可能會削弱對本研究的整體意義。其次，不良反應的發生是一個重要的問題，但在本研究中沒有這方面的詳細信息描述。最后，誘導型大環內酯耐藥是膿腫分枝桿菌耐藥的重要原因，未評價大環內酯與GSK656在誘導條件下的體外協同作用。因此，對于膿腫分枝桿菌引起的疾病，選擇用藥時不能只局限于傳統藥物，而要勇于探索開發新藥及其與傳統藥物之間的組合效應，并進一步研究新藥及其藥物組合在我國膿腫分枝桿菌的藥物敏感譜，以期為制定適于我國的膿腫分枝桿菌肺病的用藥方針提供新的參考依據。

志謝首都醫科大學附屬北京胸科醫院柳芳超對本研究統計學進行了指導