fth1b基因敲除對斑馬魚咽齒早期礦化的影響研究

周春艷 鄭雪丹 楊德琴

重慶醫科大學附屬口腔醫院牙體牙髓病科 口腔疾病與生物醫學重慶市重點實驗室重慶市高等教育口腔生物醫學工程重點實驗室，重慶401147

鐵離子的動態平衡對維持有機體的正常功能起關鍵作用，越來越多的研究[1-6]發現鐵離子失衡在許多常見疾病中發揮重要作用，例如帕金森病、阿爾茲海默癥、缺血-再灌注損傷、動脈粥樣硬化、肺炎及類風濕性關節炎等。因此，細胞內精密的鐵離子調控機制對生物體極為重要。鐵蛋白是生物體內重要的調節鐵離子濃度平衡的蛋白之一，參與多種生物過程。它由24 個亞基組成的一個內徑為8 nm、外徑約為12 nm 的一個中空球體狀蛋白[7]，內部形成礦化核約可以儲存4 500 個鐵原子[8]。組成鐵蛋白的亞基包括2 種不同類型的多肽鏈：重鏈H 和輕鏈L，分別由不同的基因fth 和ftl編碼[9]，2 種亞基具有不同功能，L 亞基有吸取鐵離子貯藏于鐵蛋白中的作用[10]，H亞基主要發揮鐵氧化酶作用[11]，將二價鐵離子氧化為可溶性三價鐵離子儲存于鐵蛋白中，可以減少亞鐵離子帶來的超氧化造成的細胞損傷。在不同的生物及器官內，組成鐵蛋白的H和L亞基比例不同而發揮不同功能來維持生物體的鐵離子整體平衡[12-14]。

fth 基因的5’端非編碼區序列通常很長，包含莖環結構鐵響應原件（iron responsive element，IRE），鐵響應原件可以與胞質中的鐵調節蛋白結合[15]，從而調控鐵蛋白的轉錄翻譯，進一步影響細胞鐵離子濃度的穩態，導致鐵離子濃度失衡而損害機體健康。目前關于IRE 序列突變的研究[15-16]顯示，IRE 的突變會影響鐵蛋白mRNA 的翻譯效率，導致鐵蛋白重鏈亞基蛋白減少從而造成遺傳性鐵過載，但是關于fth 編碼基因本身的突變未見報道。

斑馬魚是分子生物學常用的模式動物之一，其產卵量大，體外受精，胚胎透明及具有終生替換咽齒等特性也使其成為牙齒發育與再生相關研究的良好模型[17]。斑馬魚咽齒的發育模式與哺乳動物具有極高的相似性[18]，早期上皮增厚形成牙板，后上皮凹陷包繞間充質，硬組織礦化形成成熟的牙齒；且組織切片染色和電鏡結果顯示，斑馬魚咽齒的顯微結構也與哺乳動物類似，由外部的類牙釉質、類牙本質和內部空腔組成[19-20]。

有研究[21]報道，鐵蛋白基因在多種動物多種細胞中均有表達。在本實驗中，首次發現編碼鐵蛋白重肽基因fth1b 在斑馬魚咽齒部位特異性表達，并利用規律成簇間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9基因編輯法的獨特優勢[22]，對該基因特異性敲除，在篩選得到的可穩定遺傳突變體（mutant，MUT）中檢測發現，斑馬魚咽齒早期形成并無明顯缺陷，包括上皮增厚及形態形成過程均正常發生，而早期礦化過程受到一定程度的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本實驗所用斑馬魚均來自于西南大學分子發育實驗室，按照國際動物管理委員會的規定在標準實驗室環境下飼養與繁殖。實驗所用斑馬魚胚胎中加入0.003% 1-苯基-2-硫脲抑制黑色素生成，便于顯微鏡下觀察。

1.2 實驗試劑及設備

rTaq DNA 聚合酶（Takara公司，日本），多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）（Sigma-Aldrich 公司，美國），無水甲醇、乙醇[重慶川東化工（集團）有限公司]，Anti Dig-AP、顯色液（Roche 公司，德國），cas9 蛋白（NEB 公司，美國），實驗設備主要包括Heraeus BK-600 立式恒溫胚胎培養箱、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀及水浴鍋（Eppendorf公司，德國），體視顯微鏡（Leica 公司，德國），共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss 公司，德國）。PCR 所用全部引物及DNA 測序均由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.3 整胚原位雜交

收集野生型（wild-type，WT）斑馬魚56、72、96、120 hpf [受精后小時（hours post fertilization，hpf）]胚胎，4%PFA 固定過夜后無水甲醇脫水并于-30 ℃儲存。按文獻[23-24]描述進行原位雜交，檢測基因fth1b、dlx2b的表達情況：1）將胚胎依次于75%甲醇/25%磷酸鹽緩沖液含吐溫20（phosphate buffer solution/tween-20，PBT）、50%甲醇/50%PBT、25%甲醇/75%PBT、100%PBT 中漂洗5 min 復水后，加入含蛋白酶K 的PBT 緩沖液消化20 min，然后加入4%PFA 固定30 min，PBT 緩沖液漂洗3次，每次5 min，固定后胚胎進入68.5 ℃水浴鍋預雜交3 h，加入探針雜交液，水浴鍋中過夜；2）回收探針雜交液，漂洗胚胎后加入封閉液室溫下封閉2 h，然后加入含抗地高辛抗體的二抗反應液，4 ℃孵育過夜；3）回收二抗后漂洗胚胎，并將胚胎轉移至24 孔板中避光顯色，顯色充分后于體式顯微鏡下觀察拍照。

1.4 利用CRISPR/Cas9 基因編輯法特異性敲除fth1b基因

從Ensembl 數據庫中下載fth1b 基因序列，根據基因序列選定合適的基因敲除靶位點，并根據靶位點設計合成正反向引物，然后通過PCR 合成能與靶位點特異性結合的導向RNA（guide RNA，gRNA），其中正向引物序列為：5,-taatacgactcactatagggtgaggcagaacttccaccgttttagagctagaaatagca-3,；反向引物序列為：5,-aaaaaaagcaccgactcggtgccac-3,。將合成的gRNA 與cas9 蛋白顯微注射到單細胞WT胚胎（約300 枚）中，gRNA 可引導cas9 蛋白到靶位點處對基因fth1b 進行特異性剪切使其編碼序列改變從而導致編碼蛋白質功能缺失。

1.5 篩選MUT 及檢測其咽齒相關基因的表達情況

經顯微注射后的胚胎飼養至性成熟后裂解魚鱗，測序檢測，篩選出MUT F0，F0 與WT 斑馬魚交配得F1，當F1 生長至3 個月大小，裂解魚鱗，測序檢測，經檢測確定的雜合MUT 與WT 斑馬魚交配得F2，性成熟后裂解魚鱗測序檢測，經檢測確定得到的雜合MUT 自交得F3，性成熟后裂解魚鱗檢測，此時經檢測確定得純合MUT，是能穩定遺傳的MUT fth1b-/-。通過篩選得到穩定遺傳的MUT 后，分別收集48、96 hpf 的MUT 胚胎及WT胚胎通過原位雜交檢測咽齒相關基因pitx2、dlx2b的表達情況。

1.6 檢測MUT咽齒礦化情況

通過共聚焦顯微鏡直接觀察及茜素紅染色的方法對MUT 發育過程中咽齒礦化情況進行檢測。茜素紅染色：分別收集野生型與MUT 120 hpf 胚胎，4%PFA 4 ℃固定過夜后PBT緩沖液漂洗5 min，50%乙醇常溫下脫水0.5 h后加入1 mL PBT和20 μL 0.05%茜素紅染色液過夜染色，然后漂白液室溫下漂白20 min，洗去漂白液，于50%甘油/0.25%氫氧化鉀中保存及圖片采集。共聚焦顯微鏡：在2.5 倍體式顯微鏡下用鑷子剝離120 hpf 野生型及MUT 胚胎的心臟等組織，充分暴露咽齒，瓊脂糖凝膠固定后于共聚焦顯微鏡下直接觀察并采集圖片。

2 結果

2.1 基因dlx2b、fth1b 在斑馬魚咽齒中的特異性表達情況

對dlx2b、fth1b 的表達情況檢測結果顯示：在56 hpf 時，咽齒部位無dlx2b 表達，在72～120 hpf各時期，dlx2b 特異性表達于斑馬魚咽齒（圖1），同時，在56 hpf時，咽齒部位無fth1b表達，在72～120 hpf，fth1b 在斑馬魚咽齒表達且在全身其他部位無表達（圖2），這表明fth1b 基因與目前公認斑馬魚咽齒標記基因dlx2b 表達情況一致，特異性表達于斑馬魚咽齒，提示此基因可能在斑馬魚咽齒的發育過程中發揮作用。

2.2 fth1b基因敲除MUT構建結果

經cas9 蛋白注射后，fth1b 基因被成功突變（圖3）。如圖3 所示，基因敲除導致在cas9 靶位點處1個堿基缺失，造成移碼突變，從而導致編碼序列改變，提前終止，編碼氨基酸由177 個減少為16個。

2.3 fth1b-/-中斑馬魚咽齒相關基因pitx2 及dlx2b 表達情況

在fth1b-/-MUT中，對pitx2、dlx2b的表達情況檢測結果顯示，48 hpf時pitx2的表達與WT斑馬魚并無較大差別，均在咽齒上皮處有較強表達（圖4）；在96 hpf時，dlx2b的表達范圍、強度與WT斑馬魚無較大差別（圖4）。此結果提示，在fth1b-/-MUT中，斑馬魚咽齒的起始及上皮增厚形態形成等過程并未受到影響。

圖2 56～120 hpf時基因fth1b在斑馬魚咽齒的表達情況Fig 2 The expression of gene fth1b in 56-120 hpf zebrafish embryos

圖3 WT斑馬魚及fth1b MUT的基因序列（A）和蛋白編碼序列（B）Fig 3 The gene sequence（A）and protein coding sequence（B）of WT zebrafish and mutant fth1b

2.4 fth1b-/-斑馬魚咽齒礦化檢測結果

通過茜素紅染色結果可以觀察到，在120 hpf時，WT 斑馬魚腹側第四位置第一顆咽齒4V1已完全礦化，腹側第三、五位置第一顆咽齒3V1及5V1處于礦化初期，僅牙尖部可見少量礦化信號，而在MUT 中，僅可見4V1礦化，3V1及5V1處未見礦化信號（圖5）；共聚焦顯微鏡下觀察，MUT 斑馬魚中，咽齒的數量及形態均與野生型斑馬魚相同，礦化稍弱（圖5）。因此，筆者認為在fth1b-/-MUT中，牙齒的早期發育及形態形成均正常，而早期礦化受到影響，即fth1b 基因在斑馬魚咽齒的礦化過程中發揮作用。

3 討論

大量研究已證實鐵離子濃度平衡對機體保持健康極為重要，其對血液系統的影響會造成缺鐵性貧血等疾病，并且過量鐵離子能通過氧化應激作用導致細胞程序性死亡，而鐵蛋白作為鐵離子濃度調節的重要蛋白，能夠作為抗氧化劑對細胞起保護作用，并且有研究報道鐵蛋白是一種有前途的藥物載體，可用于腫瘤的靶向治療。盡管對鐵蛋白功能作用的研究日益增多，但其在牙齒發育中的作用及影響尚未見報道。

圖4 基因pitx2、dlx2b在WT與MUT斑馬魚咽齒的表達情況Fig 4 The expression of gene pitx2 and dlx2b in WT and MUT embryos

圖5 120 hpf時斑馬魚咽齒數量、形態及礦化情況Fig 5 The number，shape and mineralization of zebrafish teeth at 120 hpf

早期報道表明，多個基因可以特異性標記斑馬魚咽齒，其中pitx2、dlx2b 是較為常用的標記基因，pitx2 表達于咽齒上皮，是斑馬魚咽齒最早表達的基因，標志著斑馬魚咽齒起始發育；dlx2b 表達于間充質與上皮，是神經棘細胞來源。在本實驗中，本課題組首次發現鐵蛋白重肽基因fth1b 與dlx2b 在斑馬魚的表達模式相同，特異性表達于咽齒。fth1b 基因特異性表達于斑馬魚咽齒部位，極有可能對斑馬魚咽齒的發育過程發揮作用，因此課題組首次嘗試使用CRISPR/cas9基因敲除技術特異性敲除該基因，在可穩定遺傳fth1b-/-突變體中，檢測發現，與野生型斑馬魚相比，突變體斑馬魚咽齒pitx2和dlx2b的表達均無較大差異，但茜素紅染色及共聚焦顯微鏡觀察顯示咽齒礦化減弱，意味著突變體斑馬魚咽齒起始與形態形成過程正常而早期礦化受到影響。目前對牙齒發育的大量研究集中于牙齒的發生、形態形成及干細胞探索等方面，對于牙齒礦化的研究相對較少，但是在生活中，礦化缺陷是一種危害極大的牙齒疾病，例如遺傳性乳光牙本質及釉質發育不全，牙齒極易磨損暴露牙髓，從而導致炎癥發生，嚴重影響患者生活質量。本實驗首次發現基因fth1b 在斑馬魚咽齒表達且對牙齒礦化有作用，為以后更深入探索牙齒礦化及相關疾病提供了又一證據。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。