WT1基因在監測急性髓細胞白血病微小殘留病中的臨床意義

許飛，李玲，馬慧

（寧夏醫科大學總醫院 血液科，寧夏 銀川 750004）

0 引言

急性髓細胞白血?。ˋML）是以異常分化的髓系細胞對骨髓，血液和其他組織的浸潤為特征的血液系統惡性腫[1]。雖然目前AML的完全緩解率（CR）可達到60%-80%，然而之后仍存在較高的復發率。而微小殘留?。∕RD）是AML復發的主要原因，MRD 是指AML經化療后或骨髓移植后體內殘留微量白血病細胞。準確動態評估AML患者治療后的MRD 對盡早預測復發、評價療效、指導個體化治療、有效地延長患者生存期均有重要意義[2]。同時進一步研究MRD特征性分子標志對監測MRD具有重要價值。WT1基因存在于11p13q染色體，其編碼的轉錄因子通過參與造血干細胞正常分化與促進細胞異常過度增殖兩個環節發揮重要作用。許多血液系統腫瘤及實體腫瘤均高表達WT1基因，特別是在白血病中，WT1基因的表達被作為白血病細胞存在的標志。同時，有研究報道WT1的mRNA表達水平與白血病疾病活動情況密切相關[3]。因此，本研究進一步探討WT1的mRNA水平是否可以作為AML微小殘留病的監測指標及其臨床意義。

1 對象和方法

1.1 研究對象。2017年 6月至 2019年 6月寧夏醫科大學總醫院血液內科收治住院64例初發AML患者。所有AML患者均符合國際FAB診斷標準，經骨髓細胞形態學、免疫表型、細胞核型和分子生物學結果確診。其FAB分型見表1。誘導治療及緩解后治療均參照成人急性髓細胞白血病診療指南[4]。經誘導緩解治療后，其中46例患者達完全緩解，并進行長期隨訪，其中15例患者復發。通過多參數流式細胞術（MFC）檢測完全緩解（CR）及每次鞏固化療后 MRD 水平 230人次，平均 5 次/例（3-7 次/例），RT-PCR 檢測每次鞏固化療后骨髓 WT1 基因表達水平 230人次，平均 5 次/例（3-7 次/例），同時檢測骨髓細胞形態學的變化。此外，所有患者均簽署知情同意書并通過寧夏醫科大學總醫院倫理委員會批準。

1.2 WT1定量檢測。抽取患者骨髓，用Ficoll分離骨髓單個核細胞，Trizol法提取總RNA，應用NanoDrop 2000分光光度儀檢測RNA濃度及純度，所有樣本符合A260/A280 ≥1.8。取1ug RNA進行逆轉錄，并應用一步法RT-qPCR WT1試劑盒；反應條件：42攝氏度30分鐘，94攝氏度變性5分鐘，94攝氏度變性15秒，60攝氏度退火1分鐘，循環40次。擴增反應在ABI 7500（美國Thermo Fisher公司產品）中進行，內參基因選用ABL基因。

1.3 MFC檢測MRD。選擇髓系抗原：CyMPO、CD13、CD33、CDw65、CD14、CD15、CD64、CD117等。取1×106個骨髓細胞與上述抗體在室溫孵育15分鐘，用氯化銨溶血后加生理鹽水300G 5分鐘離心洗滌一次，棄上清，用生理鹽水懸浮細胞，并應用Cytomics? FC-500 流式細胞儀進行檢測。分析 CD45/SS 散點圖的各群細胞抗原表達情況，取10000 個細胞，通過計算得出表達目標抗原的細胞之和所占細胞總數的百分比。本研究選取閾值為1%，MRD>1%為高水平，≤1%為低水平。

1.4 統計學處理。采用 SPSS 23．0 軟件進行統計學分析。兩組間WT1 mRNA水平比較應用獨立樣本t檢驗，率的比較用χ2檢驗，相關性分析應用Spearman相關系數，P<0.05 表示差異有統計學意義。

表1 64例AML患者的一般資料

2 結果

2.1 WT1 mRNA水平在AML患者初發、CR及復發期的變化。RT-qPCR證明WT1表達在初發AML患者中的表達明顯高于CR及復發期表達水平（P<0.01），見圖1；在AML各亞型間M3的WT1表達最高，且差異有統計學意義（P<0.01），見圖2。

2.2 AML患者CR后骨髓MRD與WT1表達水平的相關性。對AML患者CR狀態的骨髓行MRD及WT1基因表達水平相關性分析，結果提示二者呈正相關（r=0.47，P<0.01）。

圖1 WT1 mRNA表達水平在AML初發患者、完全緩解及復發組中的差異

圖2 WT1 mRNA表達水平在AML患者不同亞型（M1-M6）中的比較

2.3 聯合動態監測AML患者CR后骨髓MRD及WT1表達水平與AML復發的關系。46例AML患者CR后，骨髓MRD與WT1任一水平增高組20例，復發11例（55%）骨髓MRD與WT1均水平降低組18例，復發2例（11%），兩者復發率差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

WT1 基因于1990年被學者Call首次發現[5]，目前許多研究認為 WT1基因具有轉錄抑制及激活的雙重作用，其能在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等實體腫瘤中的發病中發揮重要的作用[6]。之后的研究進一步發現WT1特殊的雙向調控作用也參與了造血細胞的轉錄調控，并影響其增殖和分化，同時對造血細胞的凋亡也具有重要作用[7]。有文獻報道WT1基因在幼稚細胞中高表達并抑制分化，具有癌基因特征。有學者報道初發AML患者中高表達WT1基因提示預后更差。

本研究發現，在初發AML患者中其WT1基因表達水平明顯高于完全緩解期，且復發期較完全緩解也明顯升高，說明WT1轉錄水平與AML臨床緩解和復發有關，與Marjanovic等學者報道結果一致[8]。在AML各亞型之間，我們發現M3的WT1表達水平最高，而M1的表達水平最低，與YingChan等學者結果一致[9]。在進行AML患者MRD和WT1水平相關性分析發現兩者呈正相關，對CR 后規律治療的 46例患者進行 MRD及WT1 表達水平監測，發現 CR 期間 WT1 表達增高者復發率明顯增高。進一步提示WT1基因表達可以在分子層面作為AML患者MRD的一項監測指標。因此應用RT-qPCR的方法檢測WT1基因表達可作為MRD檢測及AML疾病復發的標志，并根據 MRD 及 WT1 表達水平的變化及時調整治療方案，給予有效的干預，可明顯減低復發率，改善患者預后。

另一方面由于 WT1 基因在AML患者中高表達，以其作為治療靶點的基因腫瘤疫苗也逐漸被人們關注和研究，現已有進入臨床試驗的相關腫瘤疫苗[10]，后續我們將進一步擴大樣本量驗證上述結果，同時在分子水平探討WT1參與AML的發生機制。