微波-超聲波輔助改善黑蒜品質的研究

劉袆帆，林映妤，張浣悠，李妍馥，肖更生，王琴

(仲愷農業工程學院 輕工食品學院，廣東 廣州，510225)

黑蒜是對新鮮生蒜在高溫高濕環境下通過發酵得到的產品，即在既定環境中將蒜體本身破壞后，通過生蒜固有成分的理化反應而產生的。在黑蒜加工過程中，熱處理會引起各種化學反應，如酶促褐變和美拉德反應，使大蒜的顏色從白色變為黃色再變為深褐色。黑蒜的含糖量、總酸含量以及多酚和類黃酮的含量均高于新鮮生蒜[1-2]。JUNG等[2]發現黑蒜比新鮮生蒜具有更強的抗氧化活性。此外，黑蒜中半胱氨酸(S-allylcysteine，SAC)的含量約是生蒜的5倍[3-4]。

傳統的黑蒜加工工藝相對簡單，但發酵時間長，一般為60～90 d，生產成本高，產品周期長。液態黑蒜的發酵還包括蒜瓣的預處理和后期真空包封等操作，其發酵時間為16～19 d[5]。雖然與傳統黑蒜發酵工藝相比，黑蒜的液態發酵時間大大縮短，但預處理繁瑣且工藝條件必須嚴格控制。與此同時，三段變溫恒濕發酵法也可用于制作黑蒜，該工藝發酵時間一般為41 d，比傳統發酵工藝時間短，發酵所得產品質量好。鑒于這些優點，本研究采用三段式變溫恒濕發酵法制備黑蒜。

近年來微波-超聲波輔助技術被廣泛應用于植物有效成分提取，能夠加快細胞釋放多糖，提高多糖提取率。YU等[6]研究明確微波-超聲輔助技術下植物多糖的提取率比于自然浸出提高了6.67%。

本文以單頭大蒜和多瓣大蒜為原料，采用微波-超聲波輔助技術和三段變溫發酵法生產黑蒜。通過對加工過程中黑蒜品質指標的測定，建立品質評價模型，為優化和控制黑蒜加工過程中的品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮新蒜，購自廣東省河源市本地農貿市場。

超純水(Milli-Q系統)，馬薩諸塞州比勒利卡市密理博公司；NaOH，中國北京百靈威科技有限公司；無水葡萄糖，中國上海博奧生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸，中國上海薩恩化學技術有限公司；其他有機、無機試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BPS-50CL恒溫恒濕箱，中國上海億恒科學儀器有限公司；CR-400比色計，日本美能達；GY-4硬度計，浙江拓普儀器公司;MesoMR23-040H-1低場核磁共振(LF-NMR)分析儀，蘇州紐邁分析儀器股份有限公司。

1.3 樣品制備

選擇表皮微黃、斑點正常、無物理損傷或異常軟化且成熟度相同的新鮮大蒜鱗莖進行加工。將鱗莖分為4組：單頭黑蒜實驗組(A)、多瓣黑蒜實驗組(B)、單頭黑蒜對照組(CA)和多瓣黑蒜對照組(CB)。各組按表1所示進行處理。預處理后，將各組樣品放入恒溫恒濕箱中，并在指定溫度和濕度下進行加工(第一階段：50～60 ℃，75～85%；第二階段：60～70 ℃，75～85%；第三階段：40～50 ℃，40～50%)。每天對加工后各組鱗莖的特性進行評估。測量分3次進行，同時進行評估，直到各組鱗莖的食物價值呈最大化(與市面上出售的黑蒜相比較)。

表1 黑蒜的加工處理組Table 1 Processing treatments for the black garlics

1.4 理化性質測定

1.4.1 色差分析

參考POEL等[7]的方法并稍作修改，通過評估每組的3個鱗莖來檢測色差。使用CR-400比色計在鱗莖的一致位置(從黑蒜體的外表面和黑蒜體凹線的內表面選擇)評估表皮顏色。黑蒜樣品的顏色使用L*a*b*色度坐標，以“a”為起始色度坐標進行定量測定，其中L*表示亮度，a*表示紅綠色，b*表示黃藍色。每組測定分3次進行。

1.4.2 硬度分析

參考文獻[8]，將硬度計預熱10 min并設置為零數值，將硬度計平行放置在測量臺上，隨后選擇鱗莖上3個點，按照恒定速度按下手柄以讀取峰值，峰值讀數記錄即為硬度值，單位為kg/cm2。

1.4.3 還原糖分析

將5.00 g黑蒜于150.00 mL去離子水中攪拌均勻，隨后在60 ℃條件下不斷攪拌3 h。使用吸濾器過濾，3,5-二硝基水楊酸(DNS)方法計算還原糖含量[9]。使用雙光束紫外可見分光光度計監測pH值，并在540 nm波長下讀取吸光度。大蒜溶液的還原糖含量按公式(1)計算。

(1)

式中：m，還原糖含量，mg/g；ρglucose solution，按吸光度值計算出的葡萄糖溶液質量濃度，mg/mL；N，物質的量；mblack garlic，黑蒜樣品質量，mg。

1.4.4 低場核磁共振分析

使用磁場強度為20.00 MHz的低場核磁共振分析儀進行核磁共振測序， Carr-Purcell-Mei-Boom-Gill(CPMG)脈沖序列從32次重復掃描中獲得2 000次回波橫向馳豫數據(T2)。每次測序重復3次。

采用Multi-Exp-Inv分析軟件對CPMG的衰減曲線進行分布指數擬合。利用軟件算法對弛豫數據進行多指數擬合分析，得到單個弛豫過程的弛豫幅度與弛豫時間的關系曲線，從峰值位置計算出各過程的時間常數，同時峰下面積(相當于水分子的弛豫時間峰面積)通過積分得出。此外，弛豫總體寬度計算作為給定峰值的觀察弛豫時間的標準偏差。

1.4.5 感官評價

選取10名專業人員對加工過程中不同時間的黑蒜樣品進行感官評估。評估基于5個預先定義的特征(顏色、干燥度、質地、氣味和味道)。得分范圍為0～20，其中0是最差的特征，20是最好的特征(表2)。將樣品冷卻至室溫，在測試前30 min準備一小盤的樣品，隨后給每個小組成員取一茶匙量進行感官評價。

表2 感官吸引力評分規則Table 2 Sensory appeal scoring rubric

1.4.6 統計分析

利用ANOVA進行方差分析。通過Duncan多重極差或最小二乘差(LSD)檢驗數據中各項平均差(P<0.05)。采用SPSS 13.0進行統計所有試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 還原糖

圖1顯示，在加工過程中隨著時間增加，黑蒜的還原糖含量不斷提高。從第6天開始，A組(圖1-c)的還原糖含量與CA組有顯著差異(P<0.05)，而B組(圖1-f)從第8天開始與CB組相比還原糖含量有顯著差異(P<0.05)。因此，微波-超聲波輔助預處理提高了黑蒜中還原糖的含量。加工至第三階段結束時，還原糖含量仍然很高，主要來源于蔗糖、葡萄糖和果糖，有可能是大蒜中多糖(如果聚糖和半乳糖)降解的產物。黑蒜中增加的還原糖(果糖和葡萄糖)含量分別促進了酸味和甜味，賦予了黑蒜果味[10]。加工至第11天，黑蒜的顏色和味道都得到了顯著改善。由此推斷，美拉德反應在第11天左右最為強烈。

圖1 黑蒜加工1(D1)、6(D6)、11(D11)和41(D41)d的LF-NMR T2弛豫時間分布a-單頭黑蒜實驗組;b-單頭黑蒜對照組;d-多瓣黑蒜實驗組;e-多瓣黑蒜對照組(每條線代表每個采樣時間的9條曲線的平均值,3個樣本中的每一個都有3個測量值)；c-單頭黑蒜加工過程中還原糖變化;f-多瓣黑蒜加工過程中還原糖含量的變化Fig.1 Distribution of LF-NMR T2 relaxations times in black garlic processed for 1(D1), 6(D6), 11(D11), and 41(D41) day*表示顯著差異(P<0.05)(下同)

2.2 色差數據分析

采用比色計對鱗莖的一致位置進行測量，并通過色度坐標記錄不同組的顏色參數。表3顯示了顏色參數(Δa、Δb、ΔL和ΔE)的平均值。O代表外表面，I代表內表面。8組的亮度具有顯著差異性(P<0.05)。單頭黑蒜表皮在加工過程中亮度均下降，多瓣黑蒜表皮亮度先升高后降低(表3)，說明隨著加工時間延長，蒜瓣的亮度降低可能是褐變減少的結果。

加工第一、第二階段固有成分的美拉德反應引起黑蒜褐變，加工第三階段進行酶促褐變。黑蒜加工第二階段中美拉德反應加快，類黑素等反應產物迅速積累。AO、AI、CAO、CAI、BO、BI組蒜瓣表皮顏色亮度呈下降趨勢，CBO和CBI組蒜瓣表皮顏色亮度先升高后降低。實驗組褐變程度高于對照組，說明微波-超聲波輔助預處理對酶促反應引起表皮顏色變化有影響。大蒜樣品的總色差(ΔE)隨著熱處理時間的延長而增大[11]。黑蒜樣品的褐變程度由加工時間的延長而增加，41 d后表皮呈黑褐色。

1)Δa代表紅色和綠色的色差，Δb代表藍色和黃色的色差，ΔL代表亮度差異, 其中正值表示蒜皮較明亮，負值表示蒜皮較暗.ΔE代表總色差, 差別越大，顏色變化越明顯

2)樣品:AO=單頭黑蒜實驗組外表皮, AI=單頭黑蒜實驗組內表皮， CAO=單頭黑蒜對照組外表皮, CAI=單頭黑蒜對照組內表皮, BO =多瓣黑蒜實驗組外表皮, BI=多瓣黑蒜實驗組內表皮, CBO=多瓣黑蒜對照組外表皮, CBI =多瓣黑蒜對照組內表皮

2.3 水分含量分析

利用低場核磁共振進行核磁共振測序，并采用CPMG序列反演法測定樣品的橫向弛豫時間，其中樣品的積分面積(標準化質子密度)與樣品中給定成分的含量成正比[12]。圖1顯示了黑蒜樣品在加工過程中CPMG弛豫衰減曲線，由于其他類型的水信號太弱而無法檢測，圖像中僅觀察到一種水類型，被定義為T2且指定為自由水[13]。隨著處理時間的延長，CPMG信號衰減變得緩慢，這說明在處理過程中水的流動性增加。如圖1-a、b、d、e所示，T2反演圖的波峰代表大蒜的水分狀態，對應的峰積分面積為A2(T2的峰面積)。

結果發現，各組處理前T2峰面積均小于加工后，說明鱗莖在加工過程中自由水含量降低。在高溫高濕條件下，黑蒜自由水含量降低，但黑蒜實驗組自由水含量高于對照組。由此合理推測微波-超聲波輔助預處理破壞了黑蒜的組織和細胞，促進了自由水在高濕度環境中的進出。

由于黑蒜中的自由水含量只受環境濕度和試驗條件的影響[14]。隨著加工時間的延長，T2弛豫時間逐漸縮短，這說明水的流動性降低，推測延長加工時間可以降低自由水的活性，并進一步限制其自由度。

圖2顯示了黑蒜的核磁共振圖像。在加工的第一和第二階段，明亮區域從蒜瓣的外部到內部逐漸增加，說明水正處于持續釋放狀態。在加工的第三階段，單頭黑蒜組的明亮區域再增加，而多瓣黑蒜對照組的明亮區域亮度正逐漸減弱，結果發現除了CB組以外其他組的自由水均轉移到了蒜瓣表面。

圖2 加工過程中1, 6, 11和41 d的黑蒜外觀Fig.2 Appearance of black garlic processed for 1, 6, 11 and 41 d

2.4 感官評價

感官評價結果如圖3所示。B組和CB組樣品的干燥度隨著時間增長而迅速下降。單頭黑蒜組的味覺得分高于多瓣黑蒜組，其中實驗組樣品的味覺得分高于對照組。每組在加工第一階段的嗅覺評估中均高于15分；在加工的第二階段，樣品顏色得分均保持不變，單頭黑蒜組味覺得分增加，而干燥度得分相似，維持在10～15分。

a-1 d;b-6 d;c-11 d;d-41 dA-單頭黑蒜實驗組；CA-單頭黑蒜對照組;B-多瓣黑蒜實驗組;CB-多瓣黑蒜對照組圖3 黑蒜在加工過程中的T2加權圖像Fig.3 T2 weighted images of black garlic processed

結果顯示，在加工第41天，實驗組的干燥得分均高于15分，單頭黑蒜對照組的干燥得分在10～15分之間，多瓣黑蒜對照組的干燥得分在5～10分(圖3-e)。在加工41 d后，實驗組的5項感官得分均超過15分(圖3-e)，而對照組均低于15分，說明微波-超聲波輔助預處理操作能夠將黑蒜的加工時間縮短至41 d。

2.5 黑蒜加工理化指標的相關性研究

圖4顯示，A組和CA組理化指標變化規律非常明顯(圖4-a)，說明黑蒜的品質隨著三段發酵過程(第一階段：1～5 d，第二階段：6～9 d，第三階段：10～41 d)的進行而變化。在第一、二段發酵期間，實驗組和對照組理化數據相對接近，而A組和CA組的理化性質在第9天開始有了顯著差異。多瓣蒜B、CB組在三段發酵法試驗初期品質變化與單頭蒜A、CA組差異顯著(圖4-b)，但理化數據無明顯變化。

a-單頭蒜品質參數氣泡圖;b-和多瓣蒜品質參數對比;c-黑蒜的自由水含量的箱式分析;d-顏色;e-氣味;f-口感圖4 黑蒜加工理化指標Fig.4 Physicochemical indexes during black garlic processing

在三段發酵過程中，不同階段的黑蒜品質不同。發酵第一階段中，實驗組與對照組的水分含量相似，而發酵第二階段A組的水分含量明顯高于CA組。B組水分含量也高于CB組，兩組間差異不顯著。發酵第三階段與前兩個階段相比(圖4-c)，各組的水分含量顯著降低。第1～8天，4組大蒜外觀色澤得分較低，蒜體呈白色或黃褐色。第9～12天，A組和CA組的物理性質數據相對集中且較高， B組和CB組的物理性質數據相對較低。A組在發酵第三階段中數據相對集中穩定，與CA組相似。B組和CB組數據也相似，但由于樣品個體差異，數據分布并不集中(圖4-d)。在嗅覺方面，第一階段各組得分有顯著差異，數據不集中，但總體呈上升趨勢；第二階段，A組的氣味數據比CA組更集中且更高，而B組的氣味數據高于CB組；第三階段，4組氣味數據波動較大，分布不集中(圖4-e)。在口感方面(圖3-f)，3個階段各組數據相對集中，A組味道得分高于CA組，B組得分高于CB組，可見黑蒜實驗組的感官品質優于對照組。

從圖5-a可以看出，水分含量與黑蒜干燥度關系最為密切，與其他指標關系不大。還原糖含量與氣味、味道和顏色3個方面密切相關，其次與大蒜質地有關。從圖5-b可以看出，影響黑蒜味道的最大因素是顏色，其次是鱗莖質地、還原糖含量和氣味(圖5-b1)。除硬度外，其他指標與氣味有關且比例相似(圖5-b2)。影響黑蒜顏色相關系數最大的是味道與還原糖含量，其次與質地、水分含量與氣味等方面有關，與干燥度和硬度無關(圖5-b3)。鱗莖質地與味道、色澤、還原糖含量、氣味這4個因素呈正相關，相關系數分別為0.45、0.49、0.28和0.25(圖4-c)。味道與顏色(0.66)、還原糖含量(0.37)、氣味(0.24)呈正相關；顏色與還原糖含量(0.58)和氣味(0.26)呈正相關；還原糖含量與氣味(0.30)呈正相關。氣味與干燥度呈負相關(-0.26)。此外，水分含量與氣味(-0.21)、還原糖含量(-0.37)、顏色(-0.27)和鱗莖質地(-0.16)呈負相關。

Venn圖結果顯示，17的數據可以直接使用單頭蒜的化學性質表示(圖6-a)，只有10的數據可以使用多瓣蒜的化學性質表示(圖6-b)，推測單頭蒜的顏色與其化學性質有較高的相關性。

a-聚類熱圖分析;b-弦圖分析;b1-味道串圖分析;b2-氣味串圖分析;b3-顏色串圖分析;c-黑蒜品質參數相關系數圖圖5 黑蒜品質參數的圖形分析Fig.5 Graphic analysis of quality parameters of black garlic

a-單頭黑蒜化學特性及其色澤Venn圖;b-多瓣黑蒜化學特性;c-單頭黑蒜的NMDS分析;d-多瓣黑蒜NMDS分析;e-味覺品質評價模型;f-氣味品質評價模型圖6 黑蒜的化學性質Fig.6 Chemical quality of black garlic

采用非計量多維標度分析(NMDS)對黑蒜的化學性質和色澤進行分析，發現單頭蒜的化學性質在整個發酵過程中呈規律性變化。從散點圖(圖6-c)結果可見，三段發酵工藝提高了單頭黑蒜的品質。多瓣蒜在發酵過程中數據變化不明顯，數據分布分散(圖6-d)，差異明顯。

在此基礎上，本文建立了2種黑蒜品質分級模型。首先，我們建立了黑蒜味覺品質分級模型(見圖5-e)。最為相關的因素是大蒜內部顏色的亮度(LI)。當LI>32.09時，評定為低質量；當LI≤32.09時，需要考察次要相關因素硬度(Hn)(表4)。

表4 黑蒜樣品(n=3)的硬度 單位：g

當Hn≤5.37時，為中等硬度；Hn>5.37時，為高硬度。第二個模型(見圖5-f)與黑蒜氣味有關，與前一個模型類似，與黑蒜味道最相關的因素是LI。當LI≤32.09時，黑蒜為優質；當LI>32.09時，需考察水分活度的次要相關因子(由核磁共振成像后峰面積確定)；當FW>10 171.91時，黑蒜為中等品質；當FW≤10 171.91時，為劣質大蒜。

3 總結與討論

為改善黑蒜品質，本文以單頭大蒜和多瓣大蒜為原料，采用微波-超聲波輔助技術預處理和三段發酵工藝進行加工得到單頭黑蒜以及多瓣黑蒜。結果顯示，在加工制成黑蒜的過程中，熱處理會引起各種化學反應，如酶促褐變和美拉德反應，使大蒜的顏色從白色變為黃色再變為深褐色。采用比色計及L*a*b*色度坐標進行定量測定，發現黑蒜樣品的褐變速率在加工第二階段最快，第三階段最慢，且黑蒜實驗組的褐變程度高于對照組。通過CPMG馳豫衰減曲線分析發現黑蒜樣品自由水含量隨著加工時間的增長而降低。感官評價雷達圖結果顯示，加工41 d后黑蒜品質達到最佳，黑蒜實驗組的感官品質明顯優于對照組，說明微波-超聲波輔助技術不僅縮短了加工時間，對黑蒜品質也有較大提高。

結合黑蒜品質與水分變化、硬度、色差、還原糖含量及感官評價等方面的相關性分析結果，發現三段發酵工藝提高了單頭黑蒜品質，但對多瓣黑蒜品質影響不大。通過熱圖、不同性質相關串圖以及NMDS綜合評價了黑蒜不同性質的相關性，其中黑蒜顏色與味道相關性系數達0.66，并還原糖含量和氣味都呈極強正相關，由此推測黑蒜性狀與其化學性質有關。YOU等[15]比較了4種不同類型的黑蒜，發現已發酵且陳化的黑蒜還原糖含量為25.90%，總酚含量為0.72 mg/mL，兩者均高于其他3種黑蒜，其抗氧化能力也顯著高于其他3種黑蒜。HYEON等[16]概述了黑蒜的理化性質和功能活性，表明黑蒜在陳化過程中總酚、總糖、類黃酮含量增加，從而提高了黑蒜的抗氧化活性。

最后根據上述結果以LI為主要因素建立簡單品質評定模型參數間相關關系，為改善黑蒜品質，提高黑蒜生產速度提供依據。今后的工作重點是將品質與功能活動相結合，建立更全面的黑蒜品質評價模型。