不同來源雞傳染性支氣管炎病毒M41株病毒特性的分析比較

張喜美　梁賢　劉曉倩　鄭叢叢　于春梅　王飛　胡曉明

摘? 要：為了比較2株不同來源的雞傳染性支氣管炎病毒（M41）毒株的生物學特性、免疫原性及S1基因同源性。將TONG-IBV和MOU-IBV分別接種10日齡SPF雞胚，觀察雞胚病變特點、計算病毒含量（EID50）、制備滅活疫苗進行免疫抗體效價檢測，進行S1基因測序分析。試驗結果表明：接種TONG-IBV株后雞胚出血較嚴重，蜷縮程度較輕，接種MOU-IBV的雞胚呈典型的蜷縮狀;MOU-IBV組抗體效價高于TONG-IBV組抗體效價;同源性分析結果顯示，MOU株S1與M41參考株S1（GenBank序列號MK937830.1）的同源性為99.7%，高于TONG 株S1與M41參考株S1的同源性99.0%。以上結果顯示，不同來源M41疫苗株的病毒特性出現了多樣性變化。

關鍵詞：雞傳染性支氣管炎病毒;M41疫苗株; 病毒特性

中圖分類號：S858.31? ? 文獻標識碼：B? ? 文章編號：1673-1085（2021）1-0021-04

雞傳染性支氣管炎（IB）是由冠狀病毒科冠狀病毒屬傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起的雞的一種急性、高度接觸傳染性疾病[1-3]。雞傳染性支氣管炎病毒極易造成呼吸道疾病的繼發感染，使疫情變得更加復雜，病死率升高，而且臨床型感染和亞臨床型感染均會使雞群生產性能下降，飼料報酬降低，且常常繼發或并發大腸桿菌病、葡萄球菌病、支原體感染等等，導致死淘率增加，給養殖業造成嚴重的經濟損失[4]。雞傳染性支氣管炎病毒M41株是目前我國生產含有IBV抗原成分滅活疫苗所使用的制苗毒株，該毒株生物學特性穩定，免疫原性良好[5]。

在實際疫苗的生產及檢驗過程中發現，部分產品中雞傳染性支氣管炎病毒效力檢驗結果偏低，甚至達不到國家標準的要求，困擾著此類疫苗的生產及應用。為了更好地保護雞免受IB的侵害，制備出最佳疫苗[6]，我們通過不同來源雞傳染性支氣管炎病毒M41株的比較，為此類疫苗生產提供參考數據。

1? 材料和方法

1.1? 毒株? 雞傳染性支氣管炎病毒（TONG-IBV株）E2代，由河南農業大學惠贈;雞傳染性支氣管炎病毒（MOU-IBV株）E2代，由山東省農業科學院家禽研究所惠贈。

1.2? 試驗用雞? SPF雞，購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司;SPF種蛋，購自濟南斯帕法斯家禽有限公司。

1.3? 檢測試劑? IB HI 試驗用抗原，購自荷蘭GD公司（批號：20680-270120）。

1.4? 設備? 組織搗碎勻漿機（JJ-2），購自常州榮華儀器制造有限公司;雞隔離器（正壓GJ-1），購自蘇州市馮氏實驗動物設備有限公司。

1.5? 試驗方法

1.5.1? 抗原的制備? 將兩株M41毒株用滅菌生理鹽水分別作100倍稀釋，經尿囊腔接種11日齡的SPF雞胚30枚，每胚0.2 mL，接種后密封針孔，置36.5 ℃繼續孵育，不必翻蛋。接種后33 h照蛋1次，棄去死胚，活胚全部取出，氣室向上直立，置于4 ℃冷卻12 h后收取尿囊液于滅菌瓶中，同時按現行《中國獸藥典》附錄進行病毒含量檢驗[7]并觀察雞胚病變特點，剩余的尿囊液-20 ℃保存備用?？乖斋@批號分別為TONG-0901、MOU-0901。

1.5.2? 抗原的滅活? 將兩株M41種毒制備的抗原加入10%甲醛溶液，隨加隨攪拌，使其充分混合，甲醛溶液的最終濃度為0.15%，37 ℃滅活18 h（以抗原溫度達到37 ℃開始計時），其間每隔4 h攪拌一次。停止滅活后，從滅活瓶內取樣進行滅活檢驗，滅活后的病毒液置4 ℃保存，抗原滅活批號分別為TONG-200901、MOU-200901。

1.5.3? 試驗疫苗的制備? 將兩組滅活后檢驗合格的抗原制備水相，按照水相和油相比1∶2在組織搗碎機進行乳化，制備兩組抗原的滅活疫苗[8]，批號分別是TONG-20200901、MOU-20200901。

1.5.4? 免疫? 用4周齡SPF雞30只，分為2組，每組15只，各點眼接種雞傳染性支氣管炎活疫苗（H120株）1羽份。接種21日后，對試驗雞采血并分離血清。第1組，各頸部皮下注射雞傳染性支氣管炎滅活疫苗（TONG）0.5 mL/只;第2組，各頸部皮下注射雞傳染性支氣管炎滅活疫苗（MOU）0.5 mL/只。接種后28日，分別采血、分離血清，并將兩次血清分別按血凝抑制試驗操作方法作HI檢測[9]。

1.5.5? 2個不同來源IBV-M41株S1基因序列分析? 參照GenBank中的IBV M41株纖突蛋白S1編碼序列附近的相對保守區設計上、下游引物，提取兩個病毒RNA，進行RT-PCR擴增，測序分析兩個不同來源M41的差異，并通過MegAlign軟件對TONG-IBV和MOU-IBV的S1編碼基因序列進行比對。

2? 試驗結果

2.1? 病毒含量測定? 結果見表1。

2.2? 雞胚病變特點? 兩株不同來源的M41分別接種11日齡SPF雞胚，雞胚病變相同點：胚體均發育小，明顯小于對照組雞胚;不同點：接種TONG-IBV雞胚出血較嚴重，蜷縮較輕，病變率73%，見圖1;接種MOU-IBV雞胚體脫水，呈典型的蜷縮狀[10]，病變率67%，見圖2;對照組見圖3。

2.3? 免疫原性分析? 試驗結果見表2。

由表2結果可見，雞傳染性支氣管炎滅活疫苗（MOU株）抗體增長倍數為6.06倍，明顯高于雞傳染性支氣管炎滅活疫苗（TONG株）抗體增長倍數1.87倍，表明MOU-IBV株的免疫原性更好。

2.4? S1基因的測序結果? 將IBV兩個疫苗株（M41）S1基因的測序結果與標準的IBV代表毒株的S1基因序列進行比較，其同源性分析與進化樹分析結果見圖4、圖5。

同源性分析結果顯示MOU-IBV-S1與M41-IBV-S1的同源性為99.7%，并且處于進化樹同一分支上，而TONG-IBV-S1與M41-IBV-S1的同源性為99.0%，因此MOU-IBV-S1與M41-IBV-S1的同源性更近。

通過MegAlign軟件對TONG-IBV、MOU-IBV纖突蛋白S1編碼基因序列比對結果見圖6、圖7。

通過MegAlign軟件對TONG-IBV、MOU-IBV纖突蛋白S1編碼基因序列比對，結果顯示二者存在4個堿基位點的突變，進一步比對其氨基酸序列，表明有3個氨基酸發生改變。第837位堿基由A突變為C，該堿基處于編碼第279位氨基酸密碼子的第三個堿基，它的突變并未引起氨基酸的變化;第851位堿基由C突變為A，該堿基位于編碼第284位氨基酸密碼子的第二個堿基，它的突變直接導致第284位氨基酸由脯氨酸P變為組氨酸H;第881位堿基由A突變為G，該堿基位于編碼第294位氨基酸密碼子的第二個堿基，它的突變直接導致第294位氨基酸由谷氨酰胺Q突變為精氨酸R，第949位堿基由G突變為A，該堿基位于編碼第317位氨基酸密碼子的第二個堿基，它的突變直接導致第317位氨基酸由谷氨酸E突變為賴氨酸K。

3? 討論

本試驗雞傳染性支氣管炎滅活疫苗（MOU-IBV株）組效價明顯高于雞傳染性支氣管炎滅活疫苗（TONG-IBV株）組，可能是由于TONG-IBV纖突蛋白S1編碼基因堿基位點的突變導致氨基酸發生突變，改變了蛋白序列及結構，從而引起了兩個M41株生物學特性和免疫原性的差異。通過對2個不同來源的雞傳染性支氣管炎病毒（M41）毒株免疫原性進行比較，說明相同的毒株之間存在著差異，導致免疫原性有所不同，有可能造成免疫失敗。本試驗為含有雞傳染性支氣管炎病毒（M41）株相關產品的研發奠定基礎。

參考文獻：

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[4]? 張建偉，李林，景小冬，等.ND-IB二聯滅活疫苗不同免疫方法對IB部分免疫效果影響試驗[J].動物保健品，2011，（上）：31-32.

[5]? 李林，章振華，景小冬，等. 不同IBV M41株滅活疫苗效力比較試驗觀察[C]//中國畜牧獸醫學會禽病學分會.中國畜牧獸醫學會禽病學分會第十六次學術研討會論文集.北京：中國畜牧獸醫學會禽病學分會，2012：75-76.

[6]? 林綺萍，唐秀英，陳瑞愛，等.不同廠家生產的雞傳染性支氣管炎三聯滅活疫苗免疫效果比較[C]//中國畜牧獸醫學會.中國畜牧獸醫學會畜牧獸醫生物技術學分會暨中國免疫學會獸醫免疫分會第七次研討會論文集.北京：中國畜牧獸醫學會，2008：440-442.

[7]? 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典（2015年版）[M].北京：中國農業出版社，2016：附錄27.

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[9]? 生藥評審處.獸用生物制品質量標準匯編（2006-2008）[M].北京：中華人民共和國農業部，2009：57-60.

[10]? 步志高，江國托，劉思國，等.傳染性支氣管炎病毒中國地方分離株RF L P基因分型的研究[J].中國獸醫學報，1997，17（6）：530-534.

Abstract：To compare the biological characteristics， immunogenicity and S1 gene homology of two strains of avian infectious bronchitis virus （M41） from different sources. The 10-day old SPF chicken embryos were inoculated with TONG-IBV and MOU-IBV， respectively， to observe the pathological features of chicken embryos， calculate the viral content （EID50）， Inactivated vaccine was prepared to detect the titer of immune antibody， S1 gene sequencing was performed. The results of the test showed that after inoculation of TONG-IBV strain， the chicken embryo bleeding was more serious and the degree of curling was less， and the chicken embryos inoculated with MOU-IBV showed a typical cowling shape. Homology analysis results showed that the homology between MOU strain S1 and M41 reference strain S1 （GenBank sequence number MK937830.1） was 99.7%， higher than that between TONG strain S1 and M41 reference strain S1 was 99.0%. The above results showed that the virus characteristics of different M41 vaccine strains showed diversity changes.

Keywords：infectious bronchitis virus; M41 vaccine strain; virus characteristics□