10-MDP-鈣鹽形成對牙本質粘接成績影響的評價

2021-02-27 07:59:52沈佳娣吳欣祎謝海峰

口腔醫學 2021年1期

王琦，沈佳娣，吳欣祎，謝海峰，陳晨

樹脂與牙本質的粘接都依賴于“混合層(HL)”的形成，它是決定粘接強度的主要因素[1]。在牙科粘接劑體系中摻入功能性單體被發現可以防止HL層的降解[2]，10-甲基丙烯酰氧基癸基磷酸二氫鹽(10-MDP)是一種使用最廣泛、最穩定的酸性功能單體，已有研究證明10-MDP可與羥基磷灰石建立穩定的化學相互作用并耐水解，從而延長HL的保存時間[3-4]。HL內暴露的膠原纖維水解是HL降解的主要因素之一，而暴露的膠原纖維極易受到人牙本質中內源性基質金屬蛋白酶(MMPs)的影響，從而導致混合層水解，降低粘接強度[5]。既然10-MDP與羥基磷灰石能夠形成鈣鹽，而這一化學結合是否有助于保護牙本質膠原纖維抵抗MMPs的降解尚值得研究。當前研究即通過微拉伸粘接強度、原位酶譜及X射線衍射分析評價10-MDP-鈣鹽的形成對牙本質粘接成績的影響。

1 材料與方法

1.1 牙本質/樹脂粘接樣本制備

經南京醫科大學倫理委員會批準，收集20顆新鮮拔除無齲人類第三磨牙，去除牙齒表面的雜質及軟組織。在流水狀態下使用低速金剛砂切割機(Isomet 1000, Buehler Ltd., Lake Bluff, IL, 美國)垂直于牙體長軸切割出16個3 mm厚的和4個1 mm厚的牙本質片，去除表面牙釉質，牙本質片表面依次使用400目和600目碳化硅砂紙濕拋光1 min，以制備玷污層。使用牙科顯微鏡(OMS2350牙科顯微鏡，Zumax，中國)仔細檢查所有的牙本質表面，以確保沒有殘留的牙釉質或牙髓暴露。然后，將牙本質儲存在4 ℃ Hanks平衡鹽溶液中，用于制備牙本質粘接試件。

本實驗所用的含10-MDP的底涂劑參照以下配方制備[6]：10%的10-MDP(DM Healthcare Products，美國)； 88.8%的無水乙醇(上海滬試，中國); 0.3%樟腦醌(CQ，阿拉丁，中國);0.9%的4-二甲基氨基苯甲酸乙酯(4EDMAB，阿拉丁，中國)。所有牙本質表面均用35%磷酸酸蝕劑(Gluma Etch 35 Gel，德國)酸蝕15 s，然后用水徹底沖洗30 s，牙本質表面用吸水紙輕拭去除多余水分。然后將16個3 mm厚的牙本質片隨機分為4組(n=4)，按照表1分組進行處理。

表1 各組牙本質試件的表面處理Tab.1 Surface treatment of dentin specimens in each group

使用含10-MDP的底涂劑涂布于10-MDP組酸蝕后的牙本質表面20 s，并用光固化燈(EliparTMS10，3M ESPE，美國)光固化20 s；將CHX(維真園，中國)涂布于CHX組酸蝕后的牙本質表面60 s，牙本質表面用吸水紙輕拭去除多余水分。隨后每組將各自使用的粘接劑涂布于牙本質表面，光固化20 s。然后，將復合樹脂(Filtek Z250，3M ESPE，美國)分兩層堆置到涂布粘接劑的牙本質表面上，每層2 mm，牢固壓實并光固化40 s。將每組的牙本質/樹脂粘接樣本在37 ℃的蒸餾水中保存24 h和6個月。

1.2 微拉伸粘接強度測試

水儲24 h或6個月后，用低速切割機將每個牙本質粘接的樣本垂直牙體長軸切成約1 mm×1 mm的柱狀試件，每個粘接樣本中取最靠近中心的4～5根柱狀試件，用電子游標卡尺(MNT-150，Meinaite，中國)測量并記錄每根試件的橫截面積，精確至0.01 mm。將每個柱狀試件用氰基丙烯酸粘接劑粘接到微拉伸裝置(micro tensile tester，BISCO，美國)的夾具上，并以1 mm/min的速度施加拉力，直到發生斷裂，記錄拉力F(N)。測量結果以MPa表示，是通過將斷裂時的作用力F(N)除以單個樣品的粘接面積得出的。記錄每組24 h和6個月水儲的微拉伸測試粘接強度(μTBS)，并計算平均值和標準差。采用SPSS 25.0軟件進行雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，P<0.05為差異有顯著性意義。

1.3 X射線衍射分析(XRD)

取0.3 g羥基磷灰石粉，分為3份，按照表1分組進行處理，反應4 h。反應完成后，加入丙酮，3 500 r/min離心20 min，倒出上清液，反復清洗3次，然后將反應殘余物放置于37 ℃恒溫箱干燥4 h。通過射線衍射儀上進行分析，工作電壓為40 kV，電流為200 mA，以連續方式進行掃描，掃描2θ范圍為0.6°～40.0°，速度為0.02°/s，記錄實驗結果。

1.4 原位酶譜分析

按照表1分組對4個1 mm厚的牙本質片表面進行處理。將厚度為1 mm的流動樹脂(Filtek Flow，3M ESPE，美國)堆置到牙本質上并光固化20 s，然后用低速切割機將其垂直于粘接界面切成1 mm厚的薄片，從厚度為1 mm的薄片中心區域切取出1 mm的柱狀試件，暴露出樹脂-粘接劑-牙本質界面。

用砂紙將柱狀試件磨至厚度為500 μm的樣本，然后用氰基丙烯酸粘接劑粘到顯微鏡載玻片上以備用。使用DQ-明膠(dyequenched-gelatin)作為MMP底物(EnzChekTMGelatinase/Collagenase Assay Kit, Thermo Fisher Scientific, 美國)進行原位酶譜分析。通過向含有DQ-明膠的管中加入1.0 mL純水制備成1.0 mg/mL熒光素標記的明膠溶液，將其儲存在-20 ℃直至使用。用1∶1的PBS緩沖液以體積比1∶8稀釋明膠原液，避光保存。用移液槍將50 μL明膠混合物置于載玻片上，使明膠混合液充分浸泡試件，并蓋上蓋玻片。將載玻片避光保存并在37 ℃恒溫箱內孵育24 h。使用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)(Zeiss LSM880 with NLO & Airyscan, 德國)進行分析，評估牙本質內源性明膠分解酶的活性。

2 結果

2.1 微拉伸測試

4組試件分別在37 ℃水浴鍋中儲存24 h和6個月后的微拉伸強度測試值，見表2。

表2 在不同水儲情況下，4組μTBS結果Tab.2 μTBS results of 4 groups under different water storage conditions MPa

上標大寫(小寫)字母表示表格中數值的橫向(縱向)比較，相同上標大寫(小寫)字母表明兩組μTBS數據沒有統計學差異(P>0.05)

使用HSD檢驗法和最小顯著性法統計分析發現，水儲24 h后，不同處理方式的4組微拉伸粘接強度均無統計學差異(P均大于0.05)，然而水儲6個月后，對照組、10-MDP組、SBU組的微拉伸粘接強度相對于24 h者均顯著降低(P<0.05)，其中對照組最低；CHX組則在水儲6個月后維持了微拉伸粘接強度的穩定(P=0.352)。

2.2 XRD

如圖1所示：對照組，10-MDP組和SBU組反應殘留物的XRD圖譜，10-MDP組和SBU組分別在2θ=4.16°，7.34°和2θ=4.66°，7.02°(箭頭所示)有兩個特征性的峰，表明MDP-鈣鹽的形成[7]。

圖1 XRD結果Fig.1 Results of XRD

2.3 原位酶譜

各組樣本經過24 h孵育后，原位酶譜結果如圖2顯示，對照組中在混合層以及牙本質小管中可以看出強烈的綠色熒光標記，這表明對照組中的明膠水解較強烈；與對照組相比，10-MDP組與SBU組熒光強度明顯減弱，表明這兩組明膠有被水解，但水解程度低于對照組，而10-MDP組與SBU組間的熒光程度沒有明顯區別；CHX組的熒光強度也較對照組低。

3 討論

R：樹脂；D：牙本質；HL：混合層圖2 原位酶譜結果Fig.2 Results of in situ zymography

CHX是一種有效和非特異性的MMPs抑制劑，在微拉伸結果中顯示，CHX組在24 h和6個月時的粘接強度無明顯區別(P>0.05)，這與原位酶譜結果一致，如圖1所示，在CHX組表現為最低的熒光強度，這與先前的研究一致[16]。Favetti等[17]提出，CHX可以在6個月內保持粘接強度的耐久性。與CHX組比較，10-MDP組和SBU組微拉伸強度均有所降低(P<0.05)，這表明雖然10-MDP-鈣鹽的形成對內源性牙本質MMPs的活性被表現為抑制，但其抑制能力并不強于CHX。

此外，在微拉伸的結果中，10-MDP組與SBU組從24 h到6個月，粘接強度表現為明顯的降低(P<0.05)。這與一些研究結果不一致[18-19]。這可能是因為將牙本質粘接樣本存儲在水環境中時，粘接劑會吸收水分，使其內部的親水性和疏水性成分發生相分離，會增加水解作用的敏感性，從而使樹脂-牙本質界面水解，導致微拉伸強度的下降[20]。