雌激素聯合機械張力調控人牙周膜成纖維細胞成骨分化及機制研究

趙 璽，李向宇，丁 銳，趙浩然，米叢波，吳曉琴

人牙周膜成纖維細胞(human periodontal ligament fibroblasts，hPDLF)是一個異質性細胞群，參與牙周組織的改建和再生，hPDLF細胞在特定的刺激下，能夠促進其向成骨細胞分化，參與組織的修復和牙槽骨的改建[1-4]。亦有研究表明[5]，雌激素與其受體結合后能夠促進牙周膜成纖維細胞在骨重建過程中核因子κB受體活化子配體及骨保護素的表達，進而影響牙槽骨的重建。正畸治療時機械力作用于牙齒通過牙周膜傳遞至牙槽骨，繼而牙槽骨發生生物改建，包含了成骨細胞和破骨細胞的分化成熟[6-8]，所以，本文即探究聯合使用雌激素和機械治療能否影響hPDLF細胞的成骨分化及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

α-MEM培養基(美國Gibco公司)；17β-雌二醇(美國Sigma公司)；cDNA合成試劑盒、qPCR檢測試劑盒(南京福麥斯生物技術有限公司)；酶標儀(美國BioTek公司)；實時定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；茜素紅染色液(沈陽萬類生物技術有限公司)；骨鈣素(osteocalcin，OCN)、骨橋蛋白(osteopontin, OPN)、β雌激素受體(Estrogen Receptor-β, ER-β)、蛋白激酶B(protein kinases, Akt)、p-蛋白激酶B(p-protein kinases, p-Akt)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)一抗，山羊抗兔二抗(武漢三鷹生物技術有限公司)，FX-5000T應力加載系統(購自美國 FlexCell公司)。

1.2 人牙周膜成纖維細胞的分離與鑒定

收集健康正畸患者的健康前磨牙6顆，患者年齡18～25歲，征得患者的知情同意。取得患者前磨牙樣本后迅速轉移至無菌的超凈工作臺中，用無菌的PBS溶液沖洗3次，然后用無菌手術刀片刮取根中1/3區域的牙周膜組織，將組織轉移至α-MEM培養基中，使用無菌眼科剪將組織剪成1 mm3，研磨均勻，將牙周膜組織碎塊均勻放置在6孔板中，加入含10%胎牛血清的α-MEM培養基，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，隔天更換培養基，細胞生長至匯合率達80%時，使用0.25%的胰蛋白酶消化，傳代。提取細胞蛋白，Western blot檢測牙周膜成纖維細胞標志蛋白波形絲蛋白(Vimentin)和細胞角蛋白(CK)的表達。

1.3 細胞給藥及細胞加力

將分離的hPDLFs接種于6孔板中，分別加入17β-雌二醇使其終濃度為0、1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L，共孵育24 h后，使用MTT法檢測雌激素對牙周膜成纖維細胞增殖能力的影響，以確定最佳給藥濃度，根據參考文獻[7]，設置細胞加力條件為：將細胞消化后，以1×108個/L分別接種于加力用細胞培養板中1/3部分，每板接種1 mL細胞懸液(即1×105個/板)，置于37 ℃恒溫孵箱中培養。使用 FX-5000T 應力加載系統分別刺激細胞12 h，振幅10%、頻率 0.5 Hz，每個循環中松弛和拉伸時間各1 s，按照上述處理方式，設置細胞分組為對照組、17β-雌二醇組、機械張力組、17β-雌二醇組聯合機械張力組。

1.4 MTT法檢測細胞增殖

取處理后的hPDLF細胞以4×103個/孔接種于96孔板，每孔200 μL，每組5個復孔，培養24 h后每孔加 MTT溶液20 μL，繼續培養 4 h，去除孔內的MTT溶液，每孔加DMSO 200 μL，酶標儀490 nm處測定各孔的光密度值(OD值)，OD值越大，細胞增殖能力越強。

1.5 茜素紅染色檢測hPDLF細胞成骨分化

配制成骨誘導液(10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，50 mg/L維生素C，10 nmol/L地塞米松，10%胎牛血清，α-MEM培養基)，分別設置為對照組(成骨誘導液)、誘導17β-雌二醇組(成骨誘導液，1×10-7mol/L 17β-雌二醇)、誘導機械張力組(成骨誘導液，機械張力)、誘導17β-雌二醇+機械張力組(成骨誘導液，1×10-7mol/L 17β-雌二醇、機械張力)，培養細胞21 d，去除培養基后使用4%多聚甲醛溶液固定20 min，加入茜素紅染液，37 ℃孵育15 min，棄茜素紅染液加入200 μL 10%氯化十六烷基吡啶溶解1 h，收集染色液，分光光度計590 nm處檢測光密度值(OD)。

1.6 qRT-PCR檢測成骨基因mRNA的表達

取各組處理后的hPDLF細胞，消化細胞至離心管中，加入Trizol裂解5 min，取上述細胞裂解液加入200 μL氯仿，靜置5 min后，于12 000×g，4 ℃離心15 min，轉移上層水相，加入500 μL異丙醇，12 000×g，4 ℃離心10 min，去上清，1 mL 75%乙醇清洗RNA沉淀后，20 μL RNA-free水重懸RNA沉淀，55 ℃水浴10 min，即為總RNA，使用核酸定量儀檢測總RNA含量。根據cDNA Synthesis 試劑盒指示配置反應體系，將提取的hPDLF細胞RNA逆轉為cDNA，然后利用核酸定量儀對cDNA進行定量。然后根據qPCR試劑盒指示配置反應體系，進行qPCR反應，采用GAPDH作為內參，反應后采用2-ΔΔCt法計算基因表達水平。引物序列見表1。

表1 RUNX2、OCN、OSX、OPN、GAPDH引物序列Tab.1 RUNX2, OCN, OSX, OPN, GAPDH primer sequences

1.7 Western blot

取各組hPDLF細胞1×106個于離心管中，每管中加入500 μL的RIPA蛋白裂解液和5 μL的苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)蛋白酶抑制劑，于冰上充分裂解30 min，裂解液12 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清，即為細胞總蛋白。BCA蛋白定量后，各組蛋白加入上樣緩沖液后，沸水浴加熱變性，然后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，用5%的脫脂牛奶對偏氟乙烯(polyvinglidene fluoride, PVDF)膜封閉2 h，然后以1∶1 000比例稀釋后的成骨相關蛋白OCN、OPN一抗，ER-β、Akt、p-Akt、GAPDH一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說明書配置發光液，并將PVDF膜浸入發光液中反應半分鐘，曝光并拍照，用Image J軟件對曝光結果進行定量分析。

1.8 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，所有數據多組間差異進行單因素方差分析，行雙側檢測，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 hPDLF細胞鑒定結果

為鑒定提取到的hPDLF細胞，首先在顯微鏡下拍照觀察細胞形態，如圖1A所示，所分離的hPDLF細胞形態呈長梭形，細胞核呈圓形狀態，細胞長滿瓶底后呈旋渦狀，符合hPDLF細胞的形態特征；Western blot鑒定hPDLF細胞標志蛋白結果(圖1B)顯示，所分離的hPDLF細胞表達Vimentin和CK，證明本文從牙組織中提取到了hPDLF細胞，可用于后續研究。

A：hPDLF細胞形態結構；B：Western blot檢測Vimentin和CK表達圖1 hPDLF細胞鑒定結果Fig.1 Results of hPDLF cell identification

2.2 17β-雌二醇對hPDLF細胞增殖能力的影響

為了驗證17β-雌二醇對hPDLF細胞增殖能力的影響，分別用1×10-9、1×10-8、1×10-7mol/L 17β-雌二醇處理hPDLF細胞，并設置0 mol/L組作為空白對照，MTT檢測結果(圖2)顯示，1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L 17β-雌二醇處理hPDLF細胞后，各組hPDLF細胞的OD值均顯著高于對照組，1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L 17β-雌二醇組細胞OD值最大，細胞增殖能力最強，且給藥濃度超過1×10-7mol/L時，OD值無顯著增加，所以選擇1×10-7mol/L作為給藥濃度，進行后續實驗。

2.3 雌激素聯合機械張力促進hPDLF細胞的增殖能力

為了探究雌激素聯合機械張力對hPDLF細胞增殖能力的影響，將hPDLF細胞分別經過1×10-7mol/L 的17β-雌二醇、機械張力以及二者聯合處理后，MTT檢測增殖能力結果(圖3)顯示，17β-雌二醇、機械張力處理hPDLF細胞后，細胞的增殖能力均顯著高于空白對照組(P<0.05)，而雌激素聯合機械張力組細胞增殖能力高于17β-雌二醇和機械張力單獨誘導組(P<0.001)，說明雌激素聯合機械張力能夠顯著促進hPDLF細胞的增殖能力。

與0 mol/L 17β-雌二醇組相比，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001圖2 MTT法檢測17β-雌二醇對hPDLF細胞增殖能力的影響Fig.2 MTT method was used to detect the effect of 17β-estradiol on the proliferation of hPDLF cells

2.4 雌激素聯合機械張力促進hPDLF細胞成骨基因的表達

為了探究雌激素聯合機械張力對hPDLF細胞成骨分化的影響，本文將hPDLF細胞經過雌激素和機械張力的刺激后，檢測成骨相關基因的表達，qPCR結果(圖4)顯示，17β-雌二醇和機械張力單獨作用組hPDLF細胞成骨相關基因RUNX2、OCN、OSX、OPN表達顯著高于對照組(P<0.05)，而17β-雌二醇聯合機械張力組細胞中RUNX2、OCN、OSX、OPN表達顯著高于17β-雌二醇和機械張力單獨作用(P<0.01)，說明雌激素聯合機械張力促進hPDLF細胞的成骨分化。

與對照組相比，*：P<0.05，***：P<0.001；與17β-雌二醇組相比，###：P<0.001；與機械張力組相比，aaa：P<0.001圖3 MTT法檢測雌激素聯合機械張力對hPDLF細胞增殖能力的影響Fig.3 MTT method was used to detect the effect of estrogen combined with mechanical tension on the proliferation ability of hPDLF cells

與對照組相比，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001；與17β-雌二醇組相比，##：P<0.01，###：P<0.001；與機械張力組相比，aa：P<0.01，aaa：P<0.001圖4 qPCR檢測雌激素聯合機械張力促進hPDLF細胞對成骨基因的表達的影響Fig.4 qPCR detection of the effect of estrogen combined with mechanical tension to promote hPDLF cells on the expression of osteogenic genes

2.5 雌激素聯合機械張力促進hPDLF細胞成骨分化

茜素紅染色檢測雌激素和機械張力對hPDLF細胞成骨分化的影響，結果(圖5)顯示，17β-雌二醇和機械張力單獨作用組hPDLF細胞茜素紅OD值顯著高于對照組(P<0.01)；17β-雌二醇聯合機械張力組茜素紅OD值顯著高于17β-雌二醇和械張力單獨作用組(P<0.001)；說明雌激素聯合機械張力可顯著促進hPDLF細胞的成骨分化。

與對照組相比， **：P<0.01，***：P<0.001；與17β-雌二醇組相比，###：P<0.001；與機械張力組相比，aaa：P<0.001圖5 茜素紅染色檢測雌激素和機械張力對hPDLF細胞成骨分化的影響Fig.5 Alizarin red staining was used to detect the effect of estrogen and mechanical tension on osteogenic differentiation of hPDLF cells

2.6 雌激素聯合機械張力促進成骨相關蛋白OCN、OPN表達及ER-β表達

Western blot檢測結果(圖6)顯示，經過17β-雌二醇和機械張力作用后，成骨相關蛋白OCN、OPN表達顯著增加(P<0.01)，雌激素受體ER-β表達顯著增加(P<0.05)，17β-雌二醇和機械張力聯合作用后，hPDLF細胞中OCN、OPN表達顯著增加(P<0.001)，ER-β表達亦顯著增加(P<0.001)，說明雌激素聯合機械張力能夠促進hPDLF細胞成骨分化，及上調雌激素受體ER-β的表達。

2.7 雌激素聯合機械張力促進Akt信號通路的激活

Western blot檢測結果(圖7)顯示，相比于對照組，17β-雌二醇組、機械張力組hPDLF細胞p-Akt磷酸化水平顯著增加(P<0.01)；而17β-雌二醇組+機械張力組hPDLF細胞p-Akt磷酸化水平均顯著高于17β-雌二醇組和機械張力組(P<0.001)，說明雌激素聯合機械張力能夠顯著促進Akt信號通路的激活。

3 討 論

hPDLF細胞是牙周膜中的主要細胞，在牙周疾病、正畸等治療中，hPDLF的成骨分化功能發揮關鍵作用[9]。已有研究表明，雌激素可影響hPDLF細胞的增殖活性，促進其成骨分化以及骨重建[10]。同時，hPDLF細胞是一種對應力敏感的細胞，受到機械應力后，將力學信號轉變為生化或生理信號，細胞骨架蛋白是最直接的外力感受器，調節受體的信號轉導[10-14]。在正畸治療中，機械張力發揮主要的治療作用，研究表明，在機械張力作用下， hPDLF細胞具有最佳的增長活力[15]。本研究就主要探究了在雌激素和機械張力的聯合作用下，hPDLF成骨分化的變化及機制。

與對照組相比，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001；與17β-雌二醇組相比，###：P<0.001；與機械張力組相比，aaa：P<0.001)圖6 Western blot檢測雌激素聯合機械張力對OCN、OPN、ER-β表達的影響Fig.6 Western blot was used to detect the effect of estrogen combined with mechanical tension on the expression of OCN, OPN, ER-β

與對照組相比，**：P<0.01，***：P<0.001；與17β-雌二醇組相比，###：P<0.001；與機械張力組相比，aaa：P<0.001)圖7 Western blot檢測雌激素聯合機械張力對Akt信號通路的影響Fig.7 Western blot was used to detect the effect of estrogen combined with mechanical tension on the Akt signaling pathway

本研究發現，雌激素聯合機械張力誘導后，hPDLF細胞的增殖能力顯著高于雌激素單獨作用和機械張力單獨作用組細胞的增殖能力，并且茜素紅染色結果顯示，雌激素聯合機械張力誘導后hPDLF細胞的成骨分化水平亦顯著增加，說明雌激素聯合機械張力能夠促進hPDLF細胞的成骨分化，提示雌激素聯合機械張力或許可以用于口腔疾病的治療，以提高治療效果。

接下來，本文即探究了其發揮促成骨分化的作用的機制，RUNX2、OCN、OPN、OSX是hPDLF細胞成骨分化的標志蛋白，可作為評價hPDLF細胞成骨分化的標志物，本研究發現，雌激素聯合機械張力誘導hPDLF細胞后RUNX2、OCN、OPN、OSX表達顯著增加，說明雌激素聯合機械張力可促進成骨分化相關基因的表達而發揮促分化的作用，并且雌激素聯合機械張力誘導后雌激素受體ER-β表達亦增加，說明二者聯合使用可通過上調ER-β表達而促進雌激素發揮功能。

PI3K/Akt信號通路的激活是通過Akt的磷酸化實現，活化的Akt通過磷酸化作用激活或抑制其下游一系列底物，從而調節細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等[16-18]。并且已經有研究表明，rhBMP9 作用于 hPDLF后可通影響PI3K/AKT 信號通路而調控成骨分化[19-20]，所以本文亦研究了雌激素聯合機械張力對hPDLF細胞PI3K/Akt信號通路的影響，結果顯示，激素聯合機械張力能夠顯著激活PI3K/Akt信號通路。

綜上所述，雌激素聯合機械張力能夠促進hPDLF細胞的成骨分化，上調成骨相關基因的表達，上調雌激素受體ER-β表達，以及激活PI3K/Akt信號通路，但其精細機制及臨床應用還需進一步驗證。