DZIP1通過影響Wnt/β-catenin信號通路促進口腔鱗狀細胞癌增殖、遷移和侵襲

庫都斯·克依木，卡米力江·買買提明，徐 前

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是頭頸部區域最常見的癌癥。它是人類10種最常見的癌癥之一，全球每年約診斷出30萬例新病例[1]。OSCC晚期診斷預后差，病死率高，盡管在放療和外科治療方面取得了一些進展，但晚期OSCC患者仍有轉移和復發風險[2]。因此，仍需努力開發更為有效的OSCC靶向療法。

Wnt/β-catenin信號通路在細胞信號傳導中起關鍵作用[3]。有研究表明，β-catenin可以與TCF/LEF轉錄因子作用以激活下游靶基因，從而促進細胞增殖、遷移和侵襲[4]。Wnt/β-catenin信號通路促進乳腺癌、大腸癌、膽管癌等癌癥細胞的增殖、遷移和侵襲[5-7]。

DAZ相互作用蛋白1(DAZ interacting protein 1，DZIP1)是一種最初在斑馬魚中鑒定出的鋅指蛋白，主要在人類胚胎干細胞和生殖細胞中表達[8-9]。DZIP1是Hedgehog信號通路重要組成部分[10]。腸上皮中的Hedgehog信號抑制Wnt信號通路，從而抑制Wnt靶基因在干細胞或祖細胞中的表達[11]。Shi等[12]證明DZIP1是膀胱癌組織中差異化表達的基因之一，并且可能對Wnt信號通路具有調控作用。最新研究證明，DZIP1是OSCC癌組織中差異化表達基因之一，與預后呈負相關[13]。綜上所述，本研究旨在探究DZIP1是否通過Wnt/β-catenin信號通路對口腔鱗狀細胞癌增殖、遷移和侵襲產生影響，以期為OSCC治療靶點的發現提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人口腔角質形成細胞(HOK)和人OSCC細胞系TSCCA、Tca8113和SCC25購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)；DMEM培養基、胎牛血清(FBS)和Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；0.25%胰蛋白酶溶液購自Gibco公司；PrimeScript RT Master Mix、SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自Takara公司；siRNA-DZIP1(si-DZIP1-1、si-DZIP1-2)和NC(negitive control)序列由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；Transwell小室、24孔細胞培養板購自Corning公司；Matrigel購自BD公司；結晶紫染液、ECL化學發光法檢測試劑盒購自Solarbio公司；RIPA裂解液購自Beyotime公司；兔抗DZIP1抗體購自GeneTex公司；鼠抗β-catenin、Cyclin D1、c-Myc、GAPDH抗體購自圣克魯斯生物技術公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京全式金生物；CCK-8購自東仁化學科技(上海)有限公司；LiCl(Wnt/β-catenin信號通路激活劑)購自Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 用含有10%FBS的DMEM培養基重懸凍存的HOK、TSCCA、Tca8113和SCC25細胞系，隨后將各細胞系轉移至細胞培養瓶中，37 ℃、5%CO2條件下繼續培養，待細胞密度達到80%～90%時，0.25%胰蛋白酶消化液消化傳代。

1.2.2 細胞轉染 轉染前一天，接種SCC25細胞于6孔板中，密度為4×105個/mL，每孔2 mL。按照分組：NC組(陰性對照組)、si-DZIP1組(si-DZIP1-1、si-DZIP1-2)、LiCl組和si-DZIP1+LiCl組，配制反應混合液。溶液A：240 μL Opti-MEMI減血清培養基+10 μL Lipofectamine 2000，室溫孵育5 min；B：Opti-MEM與待轉染物混合(NC、si-DZIP1-1、si-DZIP1-2終濃度為50 nmol/L，LiCl終濃度為10 mmol/L[14])，總體積為250 μL，室溫孵育5 min。將A液和B液混合，室溫孵育20 min。將混合液加入6孔板內，輕輕混勻，37 ℃、5%CO2培養箱培養48 h后，進行后續實驗。轉染序列見表1。

表1 轉染序列Tab.1 Transfection sequences

1.2.3 實時熒光定量PCR Trizol法提取HOK、TSCCA、Tca8113和SCC25細胞總RNA，并使用PrimeScript RT Master Mix將2 μg RNA反轉錄成cDNA。按照SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR檢測。PCR反應條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環；95℃ 15 s；60℃ 30 s；95℃ 15 s。其中GAPDH為內參。實驗所需引物見表2。

表2 實時熒光定量PCR所需引物Tab.2 Primers required for real-time PCR

1.2.4 Western blot 收集HOK、TSCCA、Tca8113和SCC25細胞(或轉染后的SCC25細胞)，RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)冰上裂解細胞，4 ℃，12 000 r/min離心20 min，取上清液。BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg蛋白進行SDS-PAGE分離。將目的蛋白轉印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，加入一抗DZIP1(1∶1 000)、β-catenin(1∶5 000)、Cyclin D1(1∶2 000)、c-Myc(1∶2 000)、GAPDH(1∶5 000)，4 ℃過夜孵育，二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h。ECL發光試劑盒顯影、曝光。

1.2.5 克隆形成實驗 0.25%胰蛋白酶消化液消化SCC25細胞，含10%FBS的DMEM培養基重懸細胞，將SCC25細胞接種于6孔板中(1×103個/孔)，37 ℃、5%CO2條件下連續培養2周。PBS清洗細胞，4%多聚甲醛固定30 min，1%結晶紫染色10 min。PBS洗滌細胞，晾干，拍照并計數。

1.2.6 CCK-8實驗 待SCC25細胞生長至80%～90%融合時，0.25%胰酶消化液消化細胞，制成密度為5×104個/mL的細胞懸液，96孔板中每孔加入100 μL細胞懸液。37 ℃、5%CO2條件下繼續培養。在細胞培養24 h、48 h、72 h和96 h后，向孔內加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃、 5%CO2條件下孵育2 h。酶標儀測定各孔在450 nm處的光密度(OD)值。

1.2.7 Transwell實驗 遷移實驗：取100 μL SCC25細胞懸液(5×104個細胞)加入上腔室中，下腔室加入500 μL含20% FBS的DMEM培養基，37 ℃、5%CO2條件下培養24 h。5%戊二醛4 ℃條件下固定，0.1%結晶紫室溫染色30 min，顯微鏡下觀察。

侵襲實驗：用無血清DMEM培養基稀釋Matrigel(稀釋比例5∶1)。取Matrigel稀釋液加入各上腔室中，每室各100 μL，37 ℃孵育直至變為固態。取100 μL SCC25細胞懸液(5×104個細胞)加入上腔室中，下腔室加入500 μL含20% FBS的DMEM培養基，37 ℃、5%CO2條件下培養24 h。5%戊二醛4 ℃條件下固定，0.1%結晶紫室溫染色30 min，顯微鏡下觀察。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 HOK、TSCCA、Tca8113和SCC25細胞系中DZIP1的差異性表達

實時熒光定量PCR和Western blot檢測HOK、TSCCA、Tca8113和SCC25細胞中DZIP1的表達，結果顯示，與HOK組相比，人OSCC細胞系TSCCA，Tca8113和SCC25中DZIP1的mRNA表達和蛋白表達均顯著升高(圖1A、B，P<0.05)，其中SCC25細胞系中DZIP1表達的升高最為明顯，因此，選擇SCC25細胞系進行后續實驗。

A:實時熒光定量PCR檢測HOK、TSCCA、Tca8113和SCC25細胞系DZIP1 mRNA表達；B:Western blot檢測HOK、TSCCA、Tca8113和SCC25細胞系DZIP1 蛋白表達。a:P<0.05 vs. HOK組圖1 HOK、TSCCA、Tca8113和SCC25細胞系DZIP1的差異性表達Fig.1 Differential expression of DZIP1 in HOK, TSCCA, Tca8113, and SCC25 cell lines

2.2 si-DZIP1干擾效率篩選

SCC25細胞分別轉染si-DZIP1-1、si-DZIP1-2和NC序列，實時熒光定量PCR和Western blot檢測DZIP1 mRNA和蛋白表達，結果顯示，與空白對照組相比，NC組DZIP1 mRNA和蛋白表達均無明顯變化(圖2A、B，P>0.05)；與NC組相比，si-DZIP1-1、si-DZIP1-2組DZIP1 mRNA和蛋白表達均顯著降低(圖2A、B，P<0.05)，其中si-DZIP1-2敲低效果更為明顯，因此，選取si-DZIP1-2進行后續實驗，簡稱為si-DZIP1。

2.3 DZIP1促進SCC25細胞Wnt/β-catenin信號通路活化

實時熒光定量PCR和Western blot檢測Wnt/β-catenin信號通路相關基因的mRNA和蛋白表達，結果顯示，與NC組相比，si-DZIP1組β-catenin、Cyclin D1和c-Myc mRNA和蛋白表達均顯著降低(圖3A、B，P<0.05)，LiCl組SCC25細胞中β-catenin、Cyclin D1和c-Myc mRNA和蛋白表達均顯著升高(圖3A、B，P<0.05)；與si-DZIP1組相比，si-DZIP1+LiCl組細胞β-catenin、Cyclin D1和c-Myc mRNA和蛋白表達均顯著升高(圖3 A、B，P<0.05)。

A:實時熒光定量PCR檢測SCC25細胞中DZIP1 mRNA表達；B:Western blot檢測SCC25細胞中DZIP1 蛋白表達。a: P<0.05，vs. NC組圖2 si-DZIP1干擾效率篩選Fig.2 si-DZIP1 interference efficiency screening

A:實時熒光定量PCR檢測Wnt/β-catenin信號通路相關基因的mRNA表達；B:Western blot檢測Wnt/β-catenin信號通路相關基因的蛋白表達。a： P<0.05， vs. NC組；b： P<0.05， vs. si-DZIP1組圖3 實時熒光定量PCR和Western blot檢測Wnt/β-catenin信號通路相關基因的mRNA和蛋白表達Fig.3 Detection of mRNA and protein expression of genes related to the Wnt/β-catenin signaling pathway by real-time quantitative PCR and Western blot

2.4 DZIP1通過Wnt/β-catenin信號通路促進SCC25細胞增殖

CCK-8實驗檢測SCC25細胞活力，克隆形成實驗檢測SCC25細胞增殖能力，結果顯示，與NC組相比，si-DZIP1組細胞活力顯著降低(圖4A，P<0.05)，細胞增殖能力顯著降低(圖4B，P<0.05)，LiCl組細胞活力顯著升高(圖4A，P<0.05)，細胞增殖能力顯著升高(圖4B，P<0.05)；與si-DZIP1組相比，si-DZIP1+LiCl組細胞活力顯著升高(圖4A，P<0.05)，細胞增殖能力顯著升高(圖4B，P<0.05)。

2.5 DZIP1通過Wnt/β-catenin信號通路促進SCC25細胞遷移和侵襲

Transwell實驗檢測SCC25細胞遷移和侵襲能力，結果顯示，與NC組相比，si-DZIP1組細胞遷移能力顯著降低(圖5A，P<0.05)，細胞侵襲能力也顯著降低(圖5B，P<0.05)，LiCl組細胞遷移能力顯著升高(圖5A，P<0.05)，細胞侵襲能力也顯著升高(圖5B，P<0.05)；與si-DZIP1組相比，si-DZIP1+LiCl組細胞遷移能力顯著升高(圖5A，P<0.05)，細胞侵襲能力也顯著升高(圖5B，P<0.05)。

3 討 論

OSCC是全球10種最常見的癌癥之一，占頭頸部癌癥的80%～90%，具有免疫抑制性[15]。OSCC的特征是角蛋白生成、鱗狀分化、生長和轉移[16]。目前的治療方法是通過外科手術輔助化療和放療。但許多患者經治療后，仍有轉移和復發的風險[17-19]。Wnt/β-catenin信號傳導途徑可調節多種癌癥進展，與腫瘤發生相關[20-22]。有研究對TCGA數據庫中519例OSCC腫瘤和44例正常組織中DZIP1的表達進行分析，發現DZIP1是OSCC組織中失調的基因之一[13]。有研究者對膀胱癌轉移相關基因進行篩選和分類，結果顯示，DZIP1是Wnt信號通路的可能調控基因[12]。本研究旨在探究DZIP1是否通過Wnt/β-catenin信號通路對口腔鱗狀細胞癌的增殖、遷移和侵襲產生影響，以期為尋找OSCC治療靶點提供科學資料。

研究表明，DZIP1在OSCC癌組織和人OSCC細胞系中上調，與預后呈負相關[13]。本研究選取多種細胞系：人口腔角質形成細胞HOK和OSCC細胞系TSCCA、Tca8113和SCC25，應用實時熒光定量PCR和Western blot檢測各細胞系中DZIP1的mRNA表達和蛋白表達，結果顯示，與HOK組相比，TSCCA組、Tca8113組和SCC25組中DZIP1的mRNA表達和蛋白表達均顯著升高，其中SCC25組變化最明顯。

A:CCK-8檢測SCC25細胞活力；B:克隆形成實驗檢測SCC25細胞增殖能力；a: P<0.05, vs. NC組；b: P<0.05, vs. si-DZIP1組圖4 DZIP1通過Wnt/β-catenin信號通路促進SCC25細胞增殖Fig.4 DZIP1 promotes SCC25 cell proliferation through the Wnt/β-catenin signaling pathway

A:Transwell實驗檢測SCC25細胞遷移能力；B:Transwell實驗檢測SCC25細胞侵襲能力；a: P<0.05, vs. NC組；b: P<0.05, vs. si-DZIP1組圖5 DZIP1通過Wnt/β-catenin信號通路促進SCC25細胞遷移和侵襲Fig.5 DZIP1 promoting migration and invasion of SCC25 cells through the Wnt/β-catenin signaling pathway

DZIP1是Hedgehog信號通路重要組成部分[10]。腸上皮中的Hedgehog信號抑制Wnt信號通路，從而抑制Wnt靶基因在干細胞或祖細胞中的表達[11]。Shi等[12]證明DZIP1是Wnt信號通路的可能調控基因。本研究應用實時熒光定量PCR和Western blot檢測SCC25細胞中Wnt/β-catenin信號通路相關基因的mRNA表達和蛋白表達，結果顯示，敲低DZIP1會抑制Wnt/β-catenin信號通路相關基因的mRNA表達和蛋白表達，該抑制現象可被Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl逆轉，說明DZIP1介導Wnt/β-catenin信號通路活化。

當Wnt/β-catenin信號通路被激活時，β-catenin聚集在細胞核中，以促進細胞上皮表型的喪失。這個過程與腫瘤的生長和轉移密切相關[23]。研究表明，Wnt/β-catenin信號傳導可加速鼻咽癌和食道鱗癌的腫瘤進展[24]。此外，FOXD2-AS1的過表達通過Wnt/β-catenin信號通路促進非小細胞肺癌的細胞增殖、遷移和侵襲[25]。R-spondin 2-LGR4系統通過Wnt/β-catenin信號調節舌鱗狀細胞癌的生長、遷移和侵襲，上皮-間質轉化和莖樣特性[26]。本研究應用CCK-8實驗檢測SCC25細胞活力，克隆形成實驗檢測SCC25細胞增殖能力，Transwell實驗檢測SCC25細胞遷移和侵襲能力，結果顯示，敲低DZIP1能顯著降低SCC25細胞活力，抑制細胞增殖，降低細胞遷移和侵襲能力，以上抑制現象均可被LiCl逆轉，說明DZIP1通過Wnt/β-catenin信號通路促進細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，DZIP1通過影響Wnt/β-catenin信號通路促進口腔鱗狀細胞癌增殖、遷移和侵襲。而有關DZIP1是否通過影響其它信號通路發揮對口腔鱗狀細胞癌增殖、遷移和侵襲的影響，尚需進一步研究。