月經血結核桿菌FQ-PCR檢測聯合IGRA對女性生殖器結核診斷價值

陳紅梅， 王 起， 方 喆， 黃移生， 蔣 源

(湖南省長沙市湖南省胸科醫院/湖南省結核病防治所院內一科， 湖南 長沙 410006)

女性生殖器結核(FGT)是因結核桿菌感染所引起的女性生殖器疾病，該病常見于10～40歲女性，在絕經后老年婦女也可見[1]。FGT多因肺結核、腸結核等其他臟器結核血行散播所引起，其中輸卵管結核占85%～90%，其次為子宮內膜結核、卵巢結核，該病主要以發熱、盜汗、乏力、食欲不振、下腹墜痛為表現，缺乏特異性的臨床表現[2]。FGT與輸卵管性不孕、復發性流產等疾病具有較高的相關性，因此提高該病的診斷效率具有重要的意義[3]。目前對于該病的診斷除全身及婦科檢查外常以子宮內膜病理檢查、輸卵管造影、活體組織檢查等方式進行，但上述診斷方法均可對患者造成一定的損傷，對于輸卵管和不明原因不孕及復發性流產患者早期結核桿菌篩查中適用性不高。月經血結核桿菌熒光定量PCR(FQ-PCR)檢查取材過程無痛方便且被證實可用于FGT的診斷，但因取材等原因導致該診斷方法有一定的漏檢率，因此本研究旨在通過分析月經血結核桿菌FQ-PCR檢測聯合γ-干擾素釋放試驗(IGRA)對FGT的診斷價值，以期為懷疑生殖器結核的輸卵管性及不明原因不孕、復發性流產患者結核桿菌篩查提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料:選擇2016年7月至2019年9月在湖南省胸科醫院(湖南省結核病防治所)就診的輸卵管性及不明原因不孕、復發性流產患者156例進行研究。納入標準：①行宮、腹腔鏡進行常規病因學檢查；②在檢查前未接受過抗結核治療；③患者神志清醒，智力正常，愿意配合相關檢查；④患者已獲知情同意。排除標準：①合并免疫系統疾病者；②既往已確診為FGT的疑似復發患者。③其他系統結核病患者。

1.2方法:對患者進行病因學檢查、月經血結核桿菌FQ-PCR檢測及IGRA檢測。①月經血結核桿菌FQ-PCR檢測：在月經來潮1～3d，以窺陰器擴開陰道后采用無菌注射器吸取月經血1～2mL進行FQ-PCR檢測，具體操作如下：1mL月經血中加入10mL NH4Cl，渦旋混勻后靜置30min，以2500r/min轉速離心10min后取沉淀置-20℃冰箱保存備用。取40μL沉淀加入40μLDNA提取液，吹打混勻后置100℃水浴10min進行DNA提取，水浴取出后室溫靜置1h，以13000r/min轉速離心10min，取上清液10μL加入反應體系，按FQ-PCR試劑盒進行常規操作，≥50Copy則認為是陽性。DNA提取試劑盒購于德國默克公司，FQ-PCR試劑盒購于中山大學達安基因股份有限公司，采用美國伯樂公司生產的CFX96型FQ-PCR儀進行檢測。②IGRA：抽取患者空腹外周靜脈血4mL肝素抗凝后分離外周血單個核細胞，在微孔板陰性對照孔中加入50μL的細胞培養液，陽性對照孔則加入50μL植物血凝素，2個測試孔分別加以50μL的結核桿菌早期分泌抗原靶6ku蛋白(Early Seeretary Antigenic Target 6ku Protein，ESAT6)抗原(A抗原)及培養濾液蛋白10( Culture Filtrate Protein 10,CFP10)(B抗原)。在上述孔中分別加入稀釋后的外周血單個核細胞溶液100μL，按英國OxordImmunotec公司生產的試劑盒說明書進行孵育、洗滌、顯示等操作。結果判斷標準：當空白對照孔斑點數為0～5且A抗原或B抗原孔斑點數-孔板對照孔斑點數≥6；空白對照孔斑點數6～10個且A抗原或B抗原孔斑點數≥2倍孔板對照孔版點數則認為有反應性。若與上述情況不符且陽性質控對照孔正常則認為是無反應性。③金標準：常規術前檢查無異常者在月經干凈后3～7d住院，以腹腔鏡下對患者子宮、卵巢、輸卵管、盆腔情況進行檢查，對盆腔腹膜或臟器表面出現粟粒氧結節、干酪樣改變、盆腔廣泛黏連鈣化、輸卵管增粗僵硬等疑似病灶進行活檢送病理檢查，以鏡下表現及病理結果結合可確診為盆腔結核。內膜結核者宮腔鏡下可見內膜不均勻灰白色或干酪狀增生，血管豐富迂曲，嚴重者可見內膜瘢痕化，宮腔黏連，將異常組織送病理檢查，見有典型結核結節即可診斷為內膜結核。根據金標準診斷結果陽性者為病例組，陰性者為對照組。分析月經血結核分枝桿菌FQ-PCR檢測聯合IGRA單獨檢測與聯合檢測對盆腔結核及內膜結核的漏診率。漏診標準：病理檢查確診者未被檢出即為漏診，聯合檢測指2種檢測方式均未檢出病理檢查確診者即為漏診。

2 結 果

2.1一般情況:156例患者輸卵管性及不明原因不孕者共92例，經腹腔鏡臨床及病理確診為生殖器結核21例(病例組)，對照組包括子宮內膜異位5例，盆腔黏連49例，正常盆腔17例。復雜性流產患者64例，宮腔鏡臨床及病理確診為生殖器結核17例(病例組)，觀察組包括：慢性子宮內膜炎36例，正常內膜11例。兩組一般情況差異無統計學意義(P>0.05)，見表1、2。

表1 不同組輸卵管性及不明原因不孕者一般情況比較

表2 不同組復雜性流產患者一般情況比較

2.2不同診斷方法對盆腔結核漏診率比較:聯合檢測對盆腔結核漏診率為14.29%，低于月經血結核分枝桿菌FQ-PCR檢測單獨檢測的42.86%與IGRA的52.38%(P<0.05)，見表3。

表3 不同診斷方法對盆腔結核漏診率比較(n=21)

2.3不同診斷方法對內膜結核漏診率比較:聯合檢測對盆腔結核漏診率為11.76%，低于月經血結核分枝桿菌FQ-PCR檢測單獨檢測的35.29%與IGRA的52.94%(P<0.05)，見表4。

表4 月經血結核桿菌FQ-PCR檢測對FGT診斷效能分析(n=17)

3 討 論

近年隨著耐多藥結核桿菌及艾滋病的流行、抗生素及免疫抑制劑等藥物的濫用、器官移植增加等原因導致結核分枝桿菌感染性疾病的發生率明顯升高的趨勢[4]。結核分枝桿菌感染機體后，若得不到及時、有效的治療可致結核分枝桿菌在體內大量繁殖并破壞入侵白細胞而引發結核病，除毛發、牙齒及指甲外，機體所有的組織器官均可受結核分枝桿菌的感染。臨床上以肺結核最為常見，肺外結核多結核分枝桿菌呼吸系統感染后經肺部病變由血液或淋巴系統播散至全省各臟器，調查數據顯示全球每年結核新發病例超過800萬，每年有140多萬人因結核病而死亡，FGT近年來發病率也有明顯上升的趨勢，約占肺外結核的11.9%[5]。FGT目前仍是發展中國家女性不孕及復發性流產的重要病因，結核桿菌感染生殖器官后可形成慢性炎癥，輸卵管為最早感染部位，其次為內膜組織，因感染初期癥狀隱匿，常引起漏診與誤診，但隨著該病的疾病進展可經腹腔鏡及宮腔鏡發現不可逆性的病變，對患者的生殖功能造成嚴重的影響[6]。因此FGT的早診斷、早治療對于保護患者的生育功能具有重要的意義。

FGT診斷金標準目前仍以病理學為主，病理學檢查在獲取組織樣本過程可對患者造成一定損傷，同時在疾病早期患者病變不明顯難以準確獲得組織樣本，因此目前尚無一種可完全診斷生殖器結核的方法，多需要結合患者病史、臨床表現并采用多種檢測手段以綜合診斷[7]。因此對于輸卵管性及不明原因不孕、復發性流產患者中可開展生殖器結核高危患者初步篩查、病原學檢查及手術病理學診斷的階梯式診斷流程。目前臨床上對于病史、基礎體溫、子宮輸卵管造影結果提示FGT高危的患者進行病原學檢查，但傳統的培養、涂片鏡檢等病原學檢查方法檢測周期長，技術條件高，目前應用已較少。近年來隨著分子生物學技術的發展，PCR技術可通過快速擴增DNA而實現多種感染性疾病的快速診斷，尤其是FQ-PCR技術采用熒光標記探針的方法實現了定量功能且操作過程自動化程度較普通PCR更高，在減少勞動力的同時還可提高檢測的準確率，同時還可避免操作人員在使用傳統PCR電泳時接觸有毒有害試劑而保護操作人員的健康。國內關于月經血結核桿菌FQ-PCR檢測用于診斷女性生殖器結核的研究已有相關報道[8]，該研究認為月經血為子宮內膜周期性脫落及子宮內膜層血管所出的血，可有效反映子宮內膜、輸卵管等女性生殖器官的生理及病理狀態，獲取月經血這一特殊樣本過程方便無痛，相對于診斷性刮宮、腹腔鏡、宮腔鏡等有創診斷患者接受程度更高。有研究者曾對不孕癥患者取月經血、子宮內膜組織進行培養、抗酸染色及組織學檢查，結果顯示在結核桿菌培養陽性標本中月經血占約70%，該研究認為月經血結核桿菌培養陽性率高且無創，目前月經血培養已成為FGT診斷的金標準之一，但該檢測方法對操作者經驗要求較高，同時需要至少8周的時間進行檢查，不利于患者的早期診斷[9]。使用PCR診斷雖可縮短檢測時間，但漏診率較高，本研究結果顯示：本研究結果顯示：月經血結核桿菌FQ-PCR檢測對盆腔結核漏診率為42.86%，內膜結核漏診率35.29%。可能與月經血標本為血性標本，其中的血紅蛋白可抑制Taq酶活性，雖然在前處理過程已進行去除血紅蛋白的操作，但仍可引起一定的漏檢。再者月經血中結核桿菌含量較低，月經血取樣過程中為整體取樣，無法對疑似病灶進行特殊取樣使得其代表性受限，采取多次、多量取樣可能可提高診斷效能[10]。

IGRA主要利用ESAT-6抗原及CFP-10抗原刺激受試者外周血單個核細胞，再利用酶聯免疫斑點法對IFN-γ分泌細胞進行計數而診斷結核，該方法在2008年被美國FDA批準用于結核病的輔助診斷，近年來該方法被用于多種肺外結核患者的輔助診斷取得滿意的效果[11]，本研究結果顯示：聯合檢測對盆腔結核漏診率為14.29%，低于月經血結核分枝桿菌FQ-PCR檢測單獨檢測的42.86%與IGRA的52.38%(P<0.05)且聯合檢測對盆腔結核漏診率為11.76%，低于月經血結核分枝桿菌FQ-PCR檢測單獨檢測的35.29%與IGRA的52.94%(P<0.05)。IGRA檢測過程中不受卡介苗及其他肺結核分枝桿菌的影響，另外對于免疫低下或免疫抑制人群的患者結核桿菌感染T細胞檢測同樣適用，但該診斷方法無法同時預測結核病的發生、發展情況，同時該診斷方法無法確定結核桿菌感染部位，仍需結合其他相關檢查[12]。聯合診斷可彌補不同檢測方法的缺陷而提高臨床的確診率，但因IGRA對實驗室要求較高，檢測費用也相應升高，聯合診斷使患者的經濟負擔明顯增加，臨床實踐過程中可根據患者意愿先采用月經血FQ-PCR檢測，對于檢查陰性但結合臨床癥狀等其他手段分析疑似的患者可進行γ干擾素釋放試驗以提高診斷率，發揮不同診斷的優勢而達到優勢互補，使患者最大程度獲益[13]。

綜上所述，月經血結核桿菌FQ-PCR檢測及IGRA作為輸卵管性及不明原因不孕、復發性流產患者FGT早期篩查手段均存在一定的漏檢率，兩種診斷方式聯合檢測可有效降低漏檢率。雖然聯合診斷的方法可降低漏診率，但需要注意的是若出現月經血結核桿菌FQ-PCR檢測陰性但IGRA陽性時需結合病理等其他診斷方式才可進行最終確診。另外本研究為單中心研究，樣本量較少，指標有限，取得的結果可能出現一定的偏差，下一步將考慮進行多中心增加樣本量的研究以進一步證實本研究的觀點。