隱匿性乙型肝炎病毒感染的研究進展

王成偉， 咸建春

(南通大學第五附屬醫院肝病科， 江蘇 泰州 225300)

乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球重大的公共衛生問題，全球大約有20億人感染過HBV，其中約有2.57億慢性HBV感染者[1]。最新版歐洲指南將慢性HBV感染的自然史劃分為5個期，即：①HBeAg陽性慢性HBV感染、②HBeAg陽性CHB、③HBeAg陰性性慢性HBV感染、④HBeAg陰性CHB、⑤HBsAg陰性期，其中第5期也被稱作：隱匿性HBV感染(occult HBV infection，OBI )。上個世紀70年代末，在HBsAg陰性、抗-HBc陽性的供血者中發現其具有傳播HBV的風險，并由此提出了OBI。數十年來，隨著科學技術的發展，我們對OBI的認識也日趨完善。本文就OBI的定義、分型、起源、流行病學、發病機制、臨床意義、診斷進行綜述。

1 OBI的定義及分型

1.1OBI定義的基本構架：血清中HBsAg陰性、HBV DNA陽性或陰性，肝組織中的HBV DNA陽性。但各文章對OBI的定義有著細微而重要的區別，主要在于：①and/or、with/without的關系(肝組織中HBV DNA陽性伴/不伴(和/或)血清中HBV DNA陽性)，②血清及肝組織中的HBV DNA的具體水平，即：是否對HBV DNA水平進行定量描述，③肝組織中的DNA具體是哪種DNA，即：是否對肝組織中的HBV DNA進行定性描述[1～3]。2018年意大利舉辦的“關于OBI的陶爾米納專家共識會議”將OBI定義為：根據現有的檢測方法，血清乙肝表面抗原(HBsAg)檢測呈陰性，肝組織中可以檢測到具有復制能力的HBV DNA(即cccDNA)和/或血清中HBV DNA陽性，這種狀態被稱為OBI[2]。在OBI群體中，由于宿主免疫及表觀遺傳調控，肝組織中的cccDNA處于低復制狀態。因此，當血清中HBV DNA被檢測到時，往往處于低載量(<200IU/mL)，并且只能被間歇檢測到[2]。

1.2OBI的分型：根據血清學檢測結果，OBI可以分為血清學陽性及血清學陰性兩類。其中，血清學陽性的OBI(Seropositive OBI)占比80%，其血清學特征表現為：抗-HBs(hepatitis B surface antibody，抗-HBs)和/或抗-HBc(hepatitis B core antibody，抗-HBs)陽性；血清學陰性的OBI(Seronegative OBI)占比1～20%,其血清學特征表現為：抗-HBs及抗-HBc陰性，其中，感染初期即表現為血清學陰性的OBI(primary OBI)即原發性OBI已在土撥鼠動物模型中得到證實[2]。

2 OBI的起源

OBI主要起源于獲得HBsAg清除的CHB群體，其次為急性自限性乙型肝炎(Self-limiting acute hepatitis B)群體，上述二者往往表現為血清陽性的OBI，但是隨著時間進展，也可轉化為血清學陰性的OBI[2]。除原發性OBI外，還有一種特殊類型的OBI為嬰兒免疫阻斷后OBI，具體表現為：一些HBsAg陽性的孕婦所生嬰兒經過免疫阻斷(單用疫苗或聯合乙肝免疫球蛋白)后，雖然血清中HBsAg陰性、抗-HBsAg陽性(提示免疫阻斷成功)，但血清中可以檢測到HBV DNA，提示這些嬰兒免疫阻斷成功后仍可能存在OBI[2]。由于對免疫功能的消耗存在差異，上述4個來源不同的OBI的傳染性及相關并發癥(如肝硬化、HCC、HBV再激活)的風險也不同，其中獲得HBsAg清除的CHB群體的傳染性及相關并發癥的風險比急性自限性乙型肝炎及嬰兒免疫阻斷后OBI群體要高[2]。

3 OBI的流行率

目前對于OBI流行病學的調查仍然比較棘手，主要有下列幾個原因：①檢測方法的靈敏度及特異性；②HBV暴露的危險因素；③人群中的HBV流行率；④是否合并基礎肝病及其嚴重度；⑤OBI的定義。由于上述原因的存在，無法對相關數據進行分析及對比。OBI在不同地區、不同人群中的流行率差異極大，可以低至<1%，也可以高至87%，但這需要謹慎解讀，因為有上述多種因素可以影響OBI的流行率。目前，OBI的流行率主要是在供血人群及肝病人群中進行調查，但在供血人群中很少篩查出OBI，HBsAg陰性供血人群的HBV DNA檢出率通常低于0.5%[2,4]。OBI的流行率與該區域及研究群體中顯性HBV感染率相關，其中在亞洲地區有著較高的流行率[2,3]。OBI在慢性肝病患者中流行率較高，有研究表明：在HCV感染群體中達到15～33%，在隱源性肝硬化群體中達到32%，而在HCC患者中可能高達62%。OBI在有HBV感染危險因素的群體中的流行率表較高，詳見表1[2](表1為參考文獻中提及的數據)，對這部分群體需要進行定期篩查及監管[2]。由于方法學的限制，OBI在一般人群中流行率尚不明確。

表1 OBI在有HBV感染危險因素的群體中的流行率

4 OBI的發病機制

目前OBI的發病機制尚未完全闡明，大部分學者認為是多因素共同作用的結果。主要包括：病毒因素、宿主因素、其他因素。其中病毒因素包括：基因突變、病毒載量低、表觀遺傳調控、免疫復合物的形成；宿主因素包括：免疫及遺傳因素；其他因素為：合并其他病毒感染[3,5]。

4.1病毒因素：①在OBI群體中，HBV基因組中4個開放閱讀框(open reading frame)均可以發生突變，目前研究最廣泛的是PreS/S突變。PreS/S突變可以通過：影響HBsAg的抗原性、免疫原性，引起HBsAg蛋白質構象發生改變，導致其不能被常用的商業試劑檢測到，其中部分突變群體血清中的HBV水平與顯性感染者相當，這部分群體被認為是“假OBI(False OBI)”；抑制HBV的復制及分泌，進而抑制HBsAg的表達及分泌，從而使得血清中HBsAg水平低于檢測下限而導致其無法檢出。但是，PreS/S突變的特異性并不高，有研究表明部分OBI群體中檢測不到上述突變，同時部分顯性HBV感染群體中可以檢測到上述突變。②相比于HBV顯性感染者，OBI群體血清中的HBV水平較低(<200IU/mL)。同時，也有研究表明OBI群體肝組織中的cccDNA水平也比HBV顯性感染者低。因此，認為病毒載量低也與OBI相關。③表觀遺傳調控包括：HBV CpG島發生甲基化，從而抑制HBV復制；通過乙酰化cccDNA上的H3/H4組蛋白可以調控HBV表達。④血清中抗-HBs與HBsAg形成免疫復合物，導致HBsAg檢測不出。

4.2宿主因素：宿主免疫控制：①一系列長期持久的特異性T cell免疫可以抑制HBV復制。②OBI群體中，部分使用CD20單抗治療的患者可以出現HBV再激活，因此認為體液免疫在OBI中也有重要作用[6]。③在土撥鼠模型中發現固有免疫在OBI中也有相應作用[7]。宿主遺傳因素：①HLA(human leukocyte antigen，HLA)在免疫調節中發揮著重要作用，有研究表明HLA的多態性是決定HBV感染預后的重要因素。②宿主表觀遺傳修飾也可能與OBI有關。宿主細胞中的microRNAs可以調節某些宿主基因的表達，來影響HBV的復制和表達。

4.3合并其他病毒感染：合并HCV感染：①存在于同一肝細胞的HCV會抑制HBV的復制；②HCV核心蛋白通過與HBx蛋白之間相互作用抑制HBV DNA復制；③HCV非結構蛋白2(nonstructural protein 2，NS2)及5A(nonstructural protein 5A，NS5A)也會干擾HBV的復制[3,5]。合并HIV感染：有研究表明OBI合并HIV感染的群體通過HLA及其多態性，宿主表觀遺傳修飾來影響HBV的復制和表達[5]。

體外試驗表明：從OBI群體中提取的HBV DNA在體外完全具體有復制能力，且能通過輸血及器官移植傳播。此外，在免疫功能低下的OBI群體中(如：接受腫瘤化療或其他免疫抑制治療)能觀察到HBV再激活。上述證據支持：相比于病毒因素及其他因素，宿主免疫控制因素可能在OBI的形成中起到更加重要的作用[2]。

5 OBI的臨床意義

OBI的潛在危害包括：傳播(輸血、器官移植、母嬰傳播)風險、引起和/或加重相關肝臟疾病以及HBV再激活的風險(再激活應DBI的相關治療部分具體闡述)。

5.1傳播風險：OBI是乙型肝炎傳播鏈上不可忽視的傳染源，患者可以通過輸血、肝移植或者母嬰傳播的方式進行傳播，使受者感染HBV[2,3]。在一些低收入國家(尚未實施NAT(nuclei acid testing，NAT)及抗-HBc檢測)，OBI供血人群通過輸血傳播HBV仍然是一重要的衛生問題。即便在發達國家，也存在OBI供血者通過輸血傳播HBV的風險，因為導致HBV感染的最低病毒載量仍低于當前NAT的下限值[4]。有研究證實：即便在使用檢測下限為5～20IU/mL的NAT進行HBV DNA篩查時，仍會遺漏部分OBI供血人群，并導致輸血傳播HBV[4]。盡管在供血人群中很少篩查出OBI，但是OBI供血者輸血相關的HBV傳播的發生率很可能被低估了，因為：①供血者的血清中不能或只能間歇檢測到HBV DNA；②難以對受血者進行隨訪調查；③供血者的血清樣本量有限；④輸注OBI供者血液致HBV感染的受者往往無明顯的急性肝炎的臨床表現，容易被忽視及遺漏，這也可能代表了大多數的OBI供血者通過輸血傳播HBV的病例。值得慶幸的是，輸血前受者體內存在抗-HBs可顯著降低HBV感染風險。

即使在血清HBsAg清除后，HBV DNA仍可長期持續存在于HBV感染者的肝組織中。因此，OBI肝臟供者可將HBV傳播給HBsAg陰性、抗-HBc陰性和抗-HBs陰性的受者，受者感染HBV后有進展為肝炎的風險，因此建議受者使用NUCs(ETV或TAF/TDF)進行長期的預防性抗病毒治療。然而，盡管預防性抗病毒治療能夠防治肝炎的發生，卻可能無法完全預防OBI的發生。

HBsAg陽性的母親所生新生兒免疫阻斷后，盡管部分嬰幼兒在第18周時血清學檢測結果提示母嬰阻斷成功(即嬰兒HBsAg陰性且抗-HBs陽性)，但血清中仍可檢測到HBV DNA，建議連續隨訪至少至24月齡，若HBV DNA持續陽性，可考慮發生OBI[8,9]。

5.2OBI與肝臟疾病：CHB群體在獲得HBsAg清除后通常都能獲得良好的預后，但仍有一部分人會發生HCC，尤其是HBsAg清除發生50歲以上的男性及已經形成肝硬化的群體[3]。據推測，對于HBsAg血清學清除的CHB患者，若存在OBI，其HCC發生的風險并未消除，但可能會降低。在一項研究中，2.34%(7/298)的HBsAg血清學清除患者在9年的中位隨訪中發生HCC，其發生率取決于性別和HBsAg血清學清除發生的年齡[2]。目前多數學者認為：OBI在肝硬化和HCC的進展中起著重要作用。例如，在多項涉及隱源性HCC患者的回顧性研究中，發現60%～70%的患者合并有OBI[2,10]。在日本的一項涉及82例隱源性肝硬化患者的前瞻性研究中，HCC 10年累積病發生率為：合并OBI組為100%，未合并OBI組為17.6%(p = 0.008)，多變量分析證實，在這項前瞻性研究中，OBI是隱源性肝硬化中HCC發生的獨立危險因素[2]。多項前瞻性研究的結果顯示：OBI合并HCV感染患者的HCC發生率是單純HCV感染的2倍以上[2]。同時，對土撥鼠動物模型的研究證實：在土撥鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)表面抗原清除后(起源自急性自限性感染)，肝組織中仍能持續檢測到WHV DNA，肝組織病理學表現為：持續輕度的壞死性炎癥，并且伴有較高的肝癌發生率[2]。

一系列證據表明：OBI保留了顯性HBV感染的致癌機制，包括直接和間接機制，直接機制為：①HBV DNA整合到宿主基因上，②產生致癌蛋白；間接機制為：肝組織中形成長期持續輕度的壞死性炎癥，促進肝組織往肝硬化的方向發展，進而再形成HCC[2,3]。OBI患者的HBV能整合到宿主的基因組中，使宿主基因組或者HBV自身發生改變，有著直接的致癌作用。HBV DNA整合到宿主基因上，形成插入突變，破壞染色體的穩定性，引起宿主基因功能改變，引起原癌基因表達上調或者抑癌基因表達下調，最終導致腫瘤的發生，也可以導致自身的功能發生變化，產生致癌蛋白：HBx、PreS/S,這些蛋白可能會擾亂宿主基因的表達調控機制或者激活致癌信號通路，從而導致腫瘤的發生[2,3,5,11]。

OBI是否會導致肝損害及加速基礎肝病肝硬化的進展目前仍有很大爭議[2]。有部分學者發現：起源自急性自限性乙型肝炎的OBI群體肝組織中存在著長期持續的輕微的壞死性炎癥，這些群體往往無肝功能受損的臨床及生化學表現，這與在土撥鼠模型中觀察到的情況一致。同時也有研究表明：OBI群體血清中的HBV DNA載量具有波動性，HBV DNA可能被間歇檢測到，當HBV DNA復制能力一過性增強時，往往伴隨著丙氨酸氨基轉移酶(Alanine transaminase，ALT)水平的升高[2]。因為在OBI群體中對于HBV的抑制不是永恒持久的，隨著時間的推移，會出現短暫的HBV再激活進而引起肝損害[2]；另一方面，少量病毒蛋白持續刺激誘導大量的特異性的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)釋放從而導致肝損害[2]。

6 OBI的診斷和相關治療

OBI的診斷主要依賴于血清學及病毒學檢查，其中檢測方法的敏感性及特異性尤為重要，這將影響到OBI診斷準確率(防止誤診及漏診)及對危險人群的篩查及監管。首先，OBI的定義要求血清中HBsAg陰性，目前多數商用HBsAg檢測方法的檢測下限是0.05 IU/mL。然而，有研究表明：使用上述方法檢測出的陰性樣本中，有1%～48%的樣本在高靈敏的HBsAg檢測方法(檢測下限為0.005 IU/mL)中呈陽性[12,13]。通過上述高靈敏的檢測方法，可以發現更多的HBV顯性感染，防止誤診為OBI。除了靈敏度外，商用HBsAg測定方法在檢測S-逃逸變異體(S-escape variants)的能力上也存在差異[14]。因此，所有HBsAg檢測應強制使用針對HBsAg多個表位的抗-HBs探針，以確保檢測到HBV S變異體，因為其中存在部分“假OBI(False OBI)”。

OBI的診斷是基于在HBsAg陰性個體血清中檢測到HBV DNA或肝組織中檢測到具有復制能力的HBV DNA，即cccDNA。結合OBI的定義，可以發現檢測肝組織中的cccDNA是一個最直接的方式，但由于肝穿刺難以大規模推廣以及目前國內外尚無標準化的檢測方法[7]，因此，檢測血清中的HBV DNA是一種更加常用的方法，包括：實時PCR(real-time polymerase chain reaction，real-time PCR)及巢式PCR(nested polymerase chain reaction，nested PCR)。其中，至少包括S、C和X三個以上基因片段的引物作PCR檢測陽性才能診斷為OBI。整合的HBV DNA不能作為OBI診斷標準，因為其不具有復制能力。目前多數商用HBV DNA檢測方法的檢測下限是5～20 IU/mL，但有研究發現使用此下限值的NAT仍會漏診部分OBI，且其具有輸血傳播HBV的風險[4]。因此，對于血液制品的檢測，其核酸檢測(nuclei acid testing，NAT)的特異性需達到99%(如：Procleix-Ultrio Elite assay )，下限值通常在2～4 IU/mL，這樣才能有效阻斷OBI群體輸血傳播HBV[4]。OBI群體血清中的HBV DNA通常處于低載量(<200IU/mL)，同時因其載量的波動性可能被間歇檢測到，因此建議每次采集(血漿)量≥1mL，必要時可以多次取樣，以防止漏診OBI。

檢測血清中的抗-HBc常作為一種替代標志物。抗-HBc陽性通常代表著既往HBV感染，由于血清學陽性的OBI占80%，因此，抗-HBc陽性可以指定一部分群體來進行核酸檢測進而診斷或排除OBI，這有利于流行病學的研究及高危人群的初步篩查。同樣地，血清學抗-HBc陰性也不能完全排除OBI。

當OBI群體接受腫瘤化療或其他免疫抑制治療時，他們可能會發生HBV再激活，但OBI群體HBV再激活發生率低于慢性HBV感染群體[2,3,15]。OBI群體在不同條件下的HBV再激活率差異較大，詳見表2，可據此對OBI群體進行風險分層，并制定相應策略，詳見表3。其中有一類特殊群體需單獨闡述，即：OBI合并HIV(human immunodeficiency virus，HIV)感染，鑒于HIV和HBV有共同的傳播途徑，以及HIV破壞免疫系統，HBV再激活在OBI合并HIV感染的群體中也有大量報道。然而，伴隨著強效的抗逆轉錄病毒藥物的廣泛使用，包括兼顧有抗HBV活性的抗逆轉錄病毒藥物的廣泛使用，在接受恰當治療的艾滋病群體中(合并OBI)，HBV再激活的風險已經變得微不足道。但是，值得關注的是：當調整抗逆轉錄病毒治療方案(如：停用抗HBV藥物時)，合并HIV感染的OBI群體也可能會發生HBV再激活。

表2 OBI群體在不同條件下的HBV再激活率

表3 OBI群體HBV再激活風險分級及防治策略

7 小 結

OBI是一個普遍存在但容易被忽視的問題。過去數十年間，隨著血清學及病毒學檢測技術的發展，對OBI的認識日趨完善。然而仍有疑惑未得到解決：①尚無標準化檢測方法，不同研究不能進行對比及組合；②需要高靈敏的檢測方法來協助診治；③不同地區不同人群的OBI流行率尚不明確；④OBI是否會、如何、在什么情況下導致和/或加重肝臟疾病尚不明確；⑤需進一步明確OBI的傳播風險；⑥對于OBI群體的HBV再激活尚無通用的指南；⑦對于OBI的發生機制，仍需要進一步的研究。因此，對于OBI的研究依然任重而道遠。