自噬調節劑對感染日本腦炎病毒小鼠腦部細胞凋亡的影響

張金花，高明星，劉澤霖，谷長勤

(華中農業大學動物醫學院，武漢 430070)

自噬(autophagy)是維持體內平衡的一種高度保守過程[1]，該過程將細胞質的大分子、過量或受損的細胞器及病原體遞送至溶酶體降解，降解產物被機體重復循環利用[2-4]。自噬是一系列自噬體結構演變的過程，由自噬相關基因(autophagy-related gene，ATG)執行精細的調控。雷帕霉素(rapamycin, Rapa)是目前研究中常用的自噬誘導劑，其可以通過抑制mTOR(mechanistic target of rapamycin)通路來促進自噬的發生[5-6]。渥漫青霉素(wortmannin, Wort)主要通過抑制PtdIns3K Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶(PtdIns3K class Ⅲ phosphatidylinositol 3-kinase)的活性來阻止自噬體的形成[7-8]。氯喹(chloroquine, CQ)在自噬體形成的下游(晚期)抑制自噬體和溶酶體融合和/或阻止溶酶體內自噬“貨物”的降解[9-10]。細胞自噬已被證實在衰老、神經退行性疾病、心臟病、腫瘤的發生過程中發揮重要的作用[11]。細胞凋亡是一個進化上保守的過程，對于生物體的發育、生長和組織穩態至關重要[12]。細胞凋亡可被多種細胞信號激活，包括Ca2+濃度升高，氧化損傷引起的羥自由基等活性氧族(reactive oxygen species，ROS)、毒素、NO和激素刺激等[13-15]。凋亡主要信號通路有線粒體途徑與死亡受體途徑[16]。自噬及凋亡是兩種不同的機制，盡管兩者都參與決定細胞命運，它們可能在細胞中相互合作或對抗[17]。自噬在細胞中起著雙重作用，既可以作為生存機制，也可以作為死亡機制，而凋亡對細胞死亡的調節是單向的[16]，它能及時主動清除機體衰老及異常細胞發揮清道夫作用[18-19]。

日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)感染主要經皮膚毛細血管或淋巴管至單核巨噬細胞系統進行繁殖。達到一定程度后即侵入血循環，造成病毒血癥，并侵入血管內膜及各靶器官，如中樞神經系統、肝、心、肺、腎等，引起全身性病變[20-21]。細胞自噬與細胞凋亡是維持體內平衡的重要機制，在病毒感染過程中，機體可能通過凋亡或自噬機制“犧牲”感染細胞來保護其他細胞。本試驗通過自噬調控藥物處理感染JEV小鼠，分析自噬調控藥物對小鼠腦部JEV感染引起的細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

乙型腦炎病毒P3株由華中農業大學農業微生物國家重點實驗室曹勝波教授饋贈，病毒采取乳鼠腦內擴增，空斑試驗測定病毒毒價。6周齡 BABL/c 雌鼠305只，購于華中農業大學動物實驗中心。鼠源JEV E抗體腹水由華中農業大學農業微生物國家重點實驗室曹勝波教授饋贈，華中農業大學基礎獸醫病理實驗室純化使用。抗Bcl2、Bax、Cas3、Cas8及GAPDH單克隆抗體購自 ABclonal 公司。PCR引物由上海生工技術有限公司合成。

1.2 動物模型構建及臨床觀察

動物試驗遵循《湖北省實驗動物管理條例》中的規定。將305只BALB/c雌鼠分為8組，分別為DMEM(0.10 mL)對照組(Control)；JEV(105PFU，0.10 mL)感染組(JEV)；JEV(105PFU，0.10 mL)+雷帕霉素(Rapa，5.00 mg·kg-1，0.20 mL)組(JEV+Rapa)；JEV(105PFU，0.10 mL)+渥漫青霉素(Wort，1.00 mg·kg-1，0.20 mL)組(JEV+Wort)；JEV(105PFU，0.10 mL)+氯喹(CQ，50.00 mg·kg-1，0.20 mL)組(JEV+CQ)；雷帕霉素(Rapa，5.00 mg·kg-1，0.20 mL)組(Rapa)；渥漫青霉素(Wort 1.00 mg·kg-1，0.20 mL)組(Wort)；氯喹(CQ，50.00 mg·kg-1，0.20 mL)組(CQ)，其中，Rapa、Wort、CQ于感染病毒前2 h給藥，之后每天給藥，給藥時間持續10 d，給毒及給藥的方式均為腹腔注射。小鼠持續喂養20 d，每天觀察并記錄小鼠臨床癥狀，依據小鼠感染JEV后臨床癥狀評分等級，對小鼠癥狀進行評分[22]。所有試驗均按照中國湖北省華中農業大學獸醫學院研究倫理委員會推薦的方案進行。

1.3 腦組織樣品采集

小鼠在給藥及感染病毒后10、20 d進行取樣，左側腦組織凍存，右側腦大腦皮層芝麻粒大小固定于2.5%戊二醛固定液中，送至谷歌生物公司制備切片染色后TECNA110透射電鏡觀察并拍照，剩余部分固定于4%甲醛固定液中。

1.4 Tunel 染色

小鼠感染病毒后10 d，取右側腦組織固定于4%甲醛固定液中。常規二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、凋亡檢測試劑盒和Tunnel法定量檢測神經細胞凋亡。在400倍光學顯微鏡下隨機選取5個視野。正常細胞核呈藍色,陽性凋亡細胞呈棕黃色,并記錄陽性凋亡細胞數。

1.5 組織免疫熒光試驗

小鼠感染病毒后10 d，取右側腦組織制作石蠟切片。將石蠟切片脫蠟至水后，置于3%H2O2中30 min，以淬滅內源性過氧化物酶后于檸檬酸鹽緩沖液中完成抗原修復。洗滌后，切片在5%BSA中封閉1 h后，將一抗(鼠源抗JEV-E一抗，1∶100；兔源抗Bad一抗，1∶100，)4 ℃孵育過夜。洗滌后，滴加二抗(FITC Goat Anti-Mouse IgG、Cy3 Goat Anti-Rabbit IgG)孵育2 h，洗滌后，用DAPI染色，使用抗免疫熒光淬滅劑封片。計數方式為每張切片10倍鏡下的3個視野的細胞數取平均數，其中，每個視野的細胞數為150～200個。

1.6 熒光定量qPCR檢測目的基因

小鼠感染病毒后10、20 d，取左側腦組織凍存。Trizol法提取腦組織總RNA，應用TaKaRa反轉錄試劑盒將RNA反轉錄合成cDNA，應用TaKaRa熒光定量PCR試劑盒進行qPCR反應。qPCR反應的引物序列如表1。qPCR反應條件：預變性95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個 循環；熔解曲線分析，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。采用2-△△Ct分析法計算各樣本中目的基因的相對表達水平。

表1 qPCR引物序列

1.7 Western blot檢測蛋白表達量

小鼠感染JEV后10 d，取左側腦組織凍存。提取組織總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量測定，參照BCA蛋白定量試劑盒說明書進行。Western blot方法檢測Bcl2、Bax、Cas3、Cas8蛋白表達量。常規的SDS-PAGE分離的蛋白，轉膜。取出PVDF膜，用5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h。TSBT洗膜后，加入TSBT稀釋后的一抗，4 ℃孵育過夜。TSBT洗膜3次，每次10 min，加入TSBT稀釋的二抗，37 ℃ 孵育40 min。TBST洗膜3次，每次10 min，配制顯色工作液，進行免疫印跡顯色，用ImageJ軟件進行灰度值分析。以GAPDH為內參檢測腦組織Bcl2、Bax、Cas3、Cas8蛋白的相對表達量。

1.8 數據統計分析

使用Graph Pad Prism 6軟件，單因素方差分析，對各組小鼠腦組織中炎癥因子的mRNA表達進行分析并作圖。采用Image J軟件對Western blot結果中自噬及炎癥相關蛋白的灰度值進行定量統計。

2 結 果

2.1 不同處理組小鼠的臨床癥狀

對小鼠的神經癥狀進行觀察，JEV+Rapa組小鼠癥狀持續期較長，為5～20 d，且5～20 d均有小鼠出現明顯的立毛、弓背及運動功能障礙的表型癥狀。JEV組小鼠癥狀持續期較短，為5～12 d，且部分小鼠出現立毛、弓背及運動功能障礙的表型癥狀。JEV+Wort組小鼠僅在7～10 d有個別小鼠出現輕度的精神沉郁及立毛現象，之后恢復正常。其他組小鼠在飼養期間無明顯神經癥狀出現。對各組小鼠的發病率及生存率進行統計分析，JEV+Rapa組小鼠發病率為65.5%，存活率最低；JEV組小鼠發病率為32.7%；JEV+Wort組小鼠生存率達90%；JEV+CQ組小鼠生存率近100%；Control組及藥物對照組小鼠都無患病及死亡情況。

2.2 不同處理組小鼠腦部亞細胞結構變化

利用透射電鏡技術(TEM)，觀察到小鼠感染病毒后10 d，腦組織中自噬體及腦組織亞細胞結構水平的病理變化。Control組小鼠腦部線粒體無嚴重損傷。JEV組小鼠腦組織出現線粒體變圓、線粒體嵴變短的現象。JEV+Rapa組小鼠腦組織線粒體嚴重損傷，線粒體變大、變圓，線粒體嵴變短、變淺甚至消失。JEV+Wort及JEV+CQ組小鼠腦組織線粒體輕微損傷(圖1)。

箭頭.線粒體。比例尺=2 μm

2.3 不同處理組小鼠腦部細胞凋亡差異

利用Tunel染色方法，觀察小鼠感染病毒后10 d，腦組織中細胞凋亡陽性信號(圖2A)。統計分析發現，與JEV+Wort及JEV+CQ組小鼠相比，JEV+Rapa及JEV組小鼠腦組織較多細胞發生細胞凋亡(圖2B)。

A.小鼠腦組織凋亡細胞分布(紅色箭頭.棕色陽性信號)；B.小鼠腦部細胞凋亡差異分析(*.P<0.05；**.P<0.01)

2.4 不同處理組小鼠腦組織細胞凋亡與病毒感染關系分析

Bad是一個促凋亡現象的標志基因，利用組織免疫熒光技術(IF)，觀察到病毒感染10 d后不同處理組小鼠腦組織中促凋亡因子Bad與JEV-E蛋白共定位情況不同: JEV組小鼠腦組織少量神經元發生Bad與JEV-E的共定位現象；JEV+Rapa組小鼠腦組織大量神經元發生Bad與JEV-E的共定位現象；JEV+Wort組及JEV+CQ組小鼠腦組織少量神經元出現Bad紅色陽性信號及JEV-E綠色陽性信號，但不發生共定位現象(圖3)。

A.小鼠腦組織 Bad及JEV-E蛋白免疫熒光成像(紅色.Bad蛋白；綠色.JEV-E蛋白)；B.小鼠腦組織Bad與JEV-E蛋白共定位的細胞比例(*.P<0.05; **.P<0.01)

2.5 不同處理組小鼠腦組織凋亡因子mRNA表達量差異

利用qPCR技術分別檢測病毒感染后10及20 d 不同處理組小鼠腦組織凋亡因子Bax、Bcl2、Bcl-xl的mRNA相對表達量。結果顯示：不同處理組小鼠在病毒感染高峰期10 d時腦組織中Bax的表達量未發生明顯差異，而JEV+Wort組及JEV+CQ組Bcl2及Bcl-xl表達量略高于JEV組及JEV+Rapa組小鼠(P<0.05)，正常組(Control組)及單獨給藥組(Rapa組、Wort組、CQ組)小鼠腦組織無明顯變化。病毒感染后20 d，不同處理組小鼠腦組織凋亡因子表達量恢復至正常水平(圖4)。

*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001；n=3

2.6 不同處理組小鼠腦組織細胞凋亡相關蛋白表達量差異

于JEV感染后10 d收集小鼠腦組織，提取組織蛋白，應用Western blot技術評估細胞凋亡相關蛋白的表達量差異。結果顯示：不同處理組小鼠腦部Bcl-2蛋白表達量變化未發生明顯差異；與JEV+CQ組小鼠比較，JEV+Rapa及JEV組小鼠腦部Bax蛋白表達量較高(P<0.05)；與JEV及JEV+CQ組小鼠比較，JEV+Rapa組小鼠腦部Cas3表達量較高(P<0.05)(圖5)。

A.Western blot結果；B.Bcl-2/GAPDH；C.Bax/GAPDH；D.Cas3/GAPDH；E.Cas8/GAPDH；*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001；n=3

3 討 論

JEV是一種人畜共患病原體，對人類健康造成重大威脅，尤其是兒童。因此，建立與人類感染后相似的臨床癥狀及病理特征的研究模型至關重要，小鼠作為常用于研究JEV的動物模型，是較簡單且有效的研究模型。病毒的接種方式具有多樣性，依據本試驗的研究目的，腹腔注射可以模仿JEV感染嚙齒動物后通過外周血管及淋巴組織向中樞神經系統傳輸病毒的自然感染過程，是JEV接種感染小鼠的優選途徑。

JEV感染小鼠后，小鼠會出現共濟失調、運動障礙等明顯的神經癥狀[22]。本次動物試驗結果的數據顯示，自噬誘導劑Rapa調控的感染JEV的小鼠在感染后5～20 d均出現不同嚴重程度的臨床表現，包括精神沉郁、立毛、弓背及感染高峰期出現的眼球充血、后肢癱瘓及轉圈的癥狀。僅感染JEV的小鼠在病毒感染后5～10 d出現立毛、弓背、眼球充血及后肢癱瘓的臨床癥狀，后期恢復至正常。自噬早期抑制劑Wort調控的感染JEV小鼠部分出現精神沉郁、立毛、弓背的早期輕度癥狀。自噬晚期抑制劑CQ調控的感染JEV小鼠未出現明顯表型癥狀。正常組及藥物對照組小鼠未出現異常表現。JEV感染小鼠的臨床癥狀與之前相關研究[23-24]的結果一致。

JEV感染小鼠腦組織能引起神經元細胞的壞死，其中一種機制就是引起神經細胞凋亡[25]。Bad是促細胞凋亡關鍵蛋白，能正反饋調控細胞凋亡信號傳導，進而誘導細胞凋亡發生[26]。本研究對不同處理組小鼠腦組織中凋亡蛋白Bad與JEV-E蛋白的共定位情況檢測分析發現JEV及JEV+Rapa組小鼠腦組織較多神經元發生Bad與JEV-E的共定位，JEV+Wort及JEV+CQ組小鼠腦組織神經元未發生明顯共定位現象。另外，本研究對不同處理組小鼠腦部凋亡因子的表達量檢測分析發現JEV及JEV+Rapa組小鼠腦部促凋亡因子表達量呈上調趨勢。因此，結合之前的試驗結果，分析自噬抑制劑Wort及CQ減弱JEV感染引起的神經元凋亡程度，對感染JEV小鼠具有一定的保護作用。

Caspase家族是促細胞凋亡的關鍵蛋白，通過級聯反應觸發細胞凋亡[27-28]。Caspase8通過與死亡配體相似的caspase途徑和線粒體依賴途徑激活caspase3或作用于其他Caspase成員和凋亡相關死亡受體信號通路，誘導細胞凋亡[29-30]。Bcl-2家族蛋白主要控制線粒體凋亡途徑，由抗凋亡和促凋亡分子組成。Bcl-2家族蛋白主要分為3類：第1類是抗凋亡蛋白，如Bcl-xl；第2類是促凋亡蛋白，如Bax和Bak；第3類是只有BH3結構域的蛋白[31]。本研究對不同處理組小鼠腦部相關凋亡蛋白的表達量檢測分析發現自噬調控藥物對感染JEV小鼠腦部凋亡蛋白的表達量無明顯影響。結合本課題組研究[32]建立動物模型數據，分析本研究中病毒感染量較低，不足以引起明顯的細胞凋亡現象。另外，細胞自噬與細胞凋亡的相互作用較復雜，既相互協同又相互拮抗，細胞凋亡通路的激活或抑制也可能受自噬調控藥物調控的自噬過程有關。研究發現，JEV感染神經細胞系，引起內質網應激，并通過P38依賴的，CHOP蛋白介導的通路誘導細胞凋亡[33-35], 而且JNK分子在JEV感染引起的細胞凋亡中起到作用[35-36]。JEV感染引起細胞凋亡的通路復雜多樣，具體機制還需進一步研究。

本試驗建立自噬調控藥物處理的JEV小鼠模型，通過觀察感染JEV小鼠的臨床癥狀及腦部線粒體結構損傷程度，檢測分析小鼠腦部相關凋亡因子mRNA及蛋白的表達量變化，發現自噬抑制劑渥漫青霉素及氯喹對日本腦炎病毒感染引起的細胞凋亡具有一定的減弱作用，但具體機制需從多個方面深入研究。

4 結 論

建立自噬誘導劑及自噬抑制劑處理的乙型腦炎病毒感染小鼠的動物模型，經研究發現自噬抑制劑渥漫青霉素和氯喹可通過降低Caspase活性，抑制Caspase通路級聯反應，減弱乙型腦炎病毒感染小鼠后引起的細胞凋亡反應。