1株塞內卡病毒A型的基因組序列與演化分析

李 寧，郭慧芳，王白玉，喬麒龍，黃 慶，李永濤，王 增，趙 軍

(河南農業大學牧醫工程學院，鄭州 450046)

塞內卡病毒A(Senecavirus A, SVA)是小RNA病毒科(Picornaviridae)塞內卡病毒屬(Senecavirus)唯一成員，為無囊膜單股正鏈線性RNA病毒[1-3]。SVA基因組大小約為7.3 kb，由5′端非編碼區(5′-UTR)、1個編碼多聚蛋白的開放閱讀框(open reading frame, ORF)和3′端非編碼區(3′-UTR)組成[4-6]。SVA早期被稱作塞內卡谷病毒(Seneca Valley virus，SVV)，原型為SVV-001[1,7]。塞內卡病毒病(Senecavirus disease，SVD)最先于2007年在加拿大被報道，其特征是鼻吻和蹄冠部產生明顯水皰，發病母豬伴隨發熱和厭食，新生仔豬表現為腹瀉、脫水、神經癥狀和急性死亡，尤其是1～4日齡的新生仔豬發病率可達70%，病死率為15%～30%[3]。隨后在美國、加拿大、哥倫比亞、巴西、泰國、越南等國家的豬群中均報道有SVA的廣泛分布[8-16]。

在中國，SVD于2015年在廣東首次被報道，隨后在廣西、福建、湖北、河南、山東和黑龍江等省(區)陸續發生SVD疫情[17-34]。SVA引起的臨床癥狀與口蹄疫、豬水皰病、水皰性口炎等疫病的臨床癥狀相似，臨床上難以區分。SVA在我國的廣泛流行嚴重危害我國養豬業的健康發展。當前，我國尚沒有商品化疫苗控制SVA的感染，加強SVA流行毒株的分子流行病學監測對于篩選未來用于制備疫苗的候選毒株，研發行之有效的疫苗和檢測試劑至關重要。

2019年11月，筆者從河南省新鄉市長垣縣某育肥豬場送檢的臨床樣品中分離到1株SVA，本研究對其進行了全基因序列測定和分析，以期為全面了解SVA在我國的流行狀況和制定合理的防控措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 病毒

SVA CH-HNCY-2019株由河南農業大學傳染病教研室自河南新鄉長垣縣某發生典型的水皰病的育肥豬豬場分離并保存，病毒滴度為10-7TCID50· 0.1 mL-1。

1.2 引物設計和SVA基因擴增

參照SVA原型毒株SVV-001株全基因序列(GenBank登錄號：NC011349)，設計用于分段擴增SVA基因組序列的引物(表1)。提取SVA CH-HNCY-2019 病毒RNA并反轉錄成cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增SVA CH-HNCY-2019基因組片段。

表1 SVA全基因序列分段擴增引物

1.3 SVA CH-HNCY-2019全基因序列測定與比較分析

將擴增的SVA基因各片段純化后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將所得序列利用DNA Star Lasergene v7.0軟件包拼接，獲得完整病毒基因組序列并上傳到GenBank數據庫，并與GenBank上已發表的中國SVA流行毒株和國外SVA代表株序列進行同源性比對分析；應用MEGA6軟件中的Neighbor-joining統計方法繪制系統進化樹。

2 結 果

2.1 目的基因擴增

利用設計的SVA特異性引物將CH-HNCY-2019基因組進行分段擴增，擴增出8個片段，與預期的目的片段大小相符(圖1)。

M.DL2000 DNA分子質量標準; F1～F8.8個覆蓋SVA基因組的重疊片段(1 018、951、1 020、1 142、1 118, 1 248、1 100和705 bp)

2.2 SVA CH-HNCY-2019株全基因序列測定和比較分析

CH-HNCY-2019基因組全長為7 294 bp，包括671 bp的5′UTR，1個編碼2 182個氨基酸的前體多聚蛋白開放閱讀框以及76 bp具有Poly(A)特性的3′UTR。將CH-HNCY-2019 全基因組序列上傳到GenBank，獲得登錄號為MT713137。

將CH-HNCY-2019全基因組與GenBank中公布的國內外不同年代的SVA代表株的全基因序列進行遺傳進化分析顯示(圖2)，包括CH-HNCY-2019在內的所有中國毒株與美國2015年及其以后的毒株，以及哥倫比亞、巴西、越南的毒株都屬于一個大群，提示這些毒株具有相同的遺傳來源。所有中國毒株又分屬4個獨立的分支，其中，CH-HNCY-2019和另一個廣東2019年分離株CH-GDZS-2019位于大多數2017—2018年中國毒株所在的中國Ⅰ這一獨立分支中，CH-HNCY-2019與GD03/2017、CHhb17、GD01/2017、SVA/CHN/01/2017和SVV-SC-0102018屬于中國Ⅰ獨立分支的同一小分支。另外3個廣東2019年分離株CH-GDHZ01-2019、CH-GDHZ02-2019、CH-GDMZ-2019則與部分2017—2018年中國毒株屬于另一個中國Ⅱ獨立分支，中國Ⅱ分支毒株與美國2015年及其以后的毒株進化關系較近。由分離自廣東、福建和遼寧的部分2017—2018年的毒株組成的中國Ⅲ分支與哥倫比亞的毒株進化關系較近；由2015—2016年分離株組成的中國Ⅳ分支與最近報道的越南分離株和2015年的巴西分離株親緣關系較近。

全基因組序列同源性分析顯示，SVA CH-HNCY-2019毒株與其他SVA毒株的核苷酸相似性為93.2%～99.0%，與SVA原型毒株SVV-001的相似性為93.2%，與其他美國毒株的相似性為93.3%～98.1%，與加拿大毒株的相似性為95.9%～96.3%，與泰國毒株的相似性為94.4%～94.8%，與越南毒株的相似性為96.4%，與巴西毒株的相似性為97%，與哥倫比亞毒株的相似性為97.8%，與中國分離株的相似性為95.9%～99.0%。

將包括CH-HNCY-2019在內的2019年中國SVA分離株的結構基因氨基酸序列與中國其他年代的分離株以及美國經典毒株SVV-001和強毒代表株SD15-26進行比較分析發現，CH-HNCY-2019的VP1蛋白的722位氨基酸由L突變成了Q，而其他2019年中國SVA分離株CH-GDZS-2019、CH-GDMZ-2019、CH-GDHZ01-2019和CH-GDHZ02-2019，中國其他年代的分離株，以及SVV-001和SD15-26毒株的722位氨基酸均為L；VP3蛋白的499位氨基酸由A突變為V，528位氨基酸由P突變位S，582位氨基酸由E突變位K；3A蛋白的1 430位 氨基酸由A突變位V。所有2019年中國分離株的3C蛋白1 685位氨基酸均為M，而其他國內外SVA毒株3C蛋白1 685位氨基酸均為L。此外，與SVV-001相比，所有中國毒株和SD15-26毒株的VP1均存在多處相同的氨基酸替換(Q735A、E736T、A766V、G770D、F834Y和I912V)；VP2蛋白也存在3處相同的氨基酸替換(T165I、N368S和A428T)；VP3蛋白存在多處氨基酸替換(L452I、E491G、V497E、T502A和V603I)。

3 討 論

SVA在我國的廣泛流行嚴重危害我國養豬業的健康發展，本研究獲得SVA分離株CH-HNCY-2019毒株與其他SVA毒株的核苷酸相似性為93.2%～99.0%，與中國分離株的相似性為95.9%～99%，而與SVA原型毒株SVV-001的相似性最低，只有93.2%。中國自2015年以來的所有毒株在全基因組進化樹上分屬同一大群的4個不同分支，包括CH-HNCY-2019在內的5株2019年中國SVA分離株分屬兩個不同的分支。這一結果提示，我國SVA的流行株具有相同的起源，但存在多樣性，且在不斷演變。研究這些處于進化樹上不同分支的SVA中國流行株在免疫學上的交叉反應性對于研發防控SVA感染的疫苗具有重要意義。

對中國的SVA分離株的結構蛋白氨基酸序列進行比對分析結果顯示，CH-HNCY-2019的VP1、VP3蛋白均存在多位點突變。這些位點氨基酸的突變對于病毒的毒力、免疫原性和在體外細胞培養中的滴度、蝕斑大小等特性的影響值得進一步深入研究。本團隊目前正在通過反向遺傳技術進行這方面的研究。

4 結 論

成功獲得1株SVA CH-HNCY-2019全基因組序列，研究結果提示，SVA中國流行株具有多樣性，而且在不斷地演變，應加強SVA的分子流行病學調查、生物安全措施和疫苗研發以防止SVA在我國豬群中的廣泛傳播。