內生真菌誘導子對火木層孔菌次級代謝的影響

紀紅燕，吳佳妮，吳欣圓，吳秀麗，何 娜，劉 成*(.寧夏醫科大學總醫院藥劑科，銀川 750004；.寧夏醫科大學科學技術研究中心，銀川 750004；.銀川知微生物科技有限公司，銀川 750004)

桑黃(Phellinusigniarius)為多年生藥用真菌，《神農本草經》中稱其為桑耳，是國際公認的抗癌效果較好的大型藥用真菌[1-2]。前期在其子實體中發現具有抗氧化、抗腫瘤等作用的生物活性物質hispidin衍生物[3-6]。由于野生桑黃資源有限，為了尋找替代資源，前期對桑黃的基原菌種火木層孔菌的次級代謝產物進行了深入研究[7]，但并未分離得到hispidin衍生物等成分。研究發現，對菌株發酵過程進行適當地誘導調控，有利于提高活性成分的含量[8-10]。而內生真菌能夠產生一類可誘導藥用植物細胞生物合成次生代謝產物的物質，稱為內生真菌誘導子，屬于外源性誘導子[11-12]。因此，本研究利用野生桑黃子實體中的內生真菌對火木層孔菌菌株的發酵過程進行誘導調控，以hispidin衍生物等成分作為對照，初步考察內生真菌誘變對菌株次級代謝產物的影響，為藥用真菌桑黃的有效開發和野生資源替代提供依據。

1 儀器與材料

1.1儀器 SW-CJ-2FD型超凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司)；Thermo Forma 311型CO2細胞培養箱(美國Thermal公司)；SPX-250-GB型智能光照培養箱(上海龍躍儀器設備有限公司)；HYG-A型全溫搖瓶柜(常州金壇精達儀器制造有限公司)；高倍倒置光學顯微鏡-連接照相裝置(CCD)(日本Olympus公司)；RE-52型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；YM75A型高壓蒸汽滅菌鍋(上海三申醫療器械有限公司)；Hitachi S-3400N型掃描電鏡(美國EMS公司)。

1.2試藥 液體發酵培養基(商用馬丁培養基，青島高科技工業園海博生物技術有限公司)。

1.3菌種 火木層孔菌(Phellinusigniarius)由中國醫學科學院藥物研究所生物合成室戴均貴研究室提供；菌源購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC 5.95)。

2 方法

2.1內生真菌的分離與純化 取表面徹底清潔后的野生桑黃子實體在超凈工作臺中切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊，子實體小塊的表面先用10 mL·L-1次氯酸鈉消毒，再用無菌水沖洗以去除子實體表面的次氯酸鈉殘留物，反復3次，繼而采用體積分數為75%的乙醇消毒，并用無菌水沖洗，各3次。用滅菌后的刀片將經徹底消毒的組織切成直徑約為0.5 cm的薄片放入馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar medium with antibiotics，PDA)培養基中(馬鈴薯200 g·L-1，葡萄糖的質量濃度為20 g·L-1，瓊脂的質量濃度為20 g·L-1，青霉素的質量濃度為0.05 g·L-1，蒸餾水1 L)。置于28 ℃避光培養3～7 d，待內生真菌的菌絲長出后，采用反復劃線法進行純化并命名保存，待用。

2.2內生真菌的掃描電鏡顯微觀察 將真菌菌株接種于改良馬丁固體培養基，將經滅菌處理的蓋玻片以45°夾角插入菌落生長的培養基中，培養2 d后，將蓋玻片輕輕拔出，用0.1 mol·L-1的二甲砷酸鈉緩沖液快速沖洗2次，放入2.0 mL·L-1戊二醛溶液中固定2 h(有菌絲的一面朝上)。固定后，用0.1 mol·L-1二甲砷酸鈉緩沖液沖洗3次(間隔2 h更換緩沖液1次)，最后用0.1 mol·L-1二甲砷酸鈉緩沖液于4 ℃條件下固定12 h以上，依次用體積分數為30%、50%、70%、80%、90%的乙醇及乙醇脫水，每次脫水時間為10～15 min。用體積分數為95%的叔丁醇溶液置換2次，每次15 min，再用100%的叔丁醇溶液置換15 min，置換完畢后將樣品放置于-20 ℃冰箱中預冷20 min。經冷凍干燥處理，離子濺射儀噴鍍后，將制做好的樣品，放置于掃描電鏡下，在10 kV下觀察菌株的形態。

2.3生物誘導子對火木層孔菌的誘導過程

2.3.1火木層孔菌生長曲線測定 將活化好的火木層孔菌接種于真菌培養基中，于28 ℃以180 r·min-1振蕩培養，隔天取樣，培養至第20天。減壓抽濾真菌培養液，得到菌絲體，于60 ℃烘干后稱質量。以培養時間(t)為橫坐標、菌絲體干質量(g)為縱坐標，繪制火木層孔菌的生長曲線。

2.3.2生物誘導子的制備及誘導過程 挑取經純化的桑黃內生真菌菌絲體放入PDA液體培養基(去除瓊脂)中進行發酵培養，于28 ℃以180 r·min-1振蕩培養5 d。培養完成后分別將菌絲體與菌液分離(減壓抽濾)，反復用蒸餾水洗滌菌絲體3次，除去水分后轉移菌絲體至組織勻漿機中，制備菌絲體勻漿。取制備好的菌絲體勻漿5 mL放入15 mL離心管中，并添加蒸餾水至15 mL，以4 600 r·min-1離心20 min，上清液即為內生真菌誘導子，于121 ℃滅菌20 min后添加至已處于生長旺盛期的火木層孔菌液體培養液中，以相同的條件繼續培養1周。

2.4高效液相色譜分析

2.4.1樣品處理 將上述添加了真菌誘導子共培養的火木層孔菌培養液用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并后濃縮。取10 mg樣品溶解于1 mL甲醇，過濾后備用。

2.4.2色譜條件 色譜柱：Agilent XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動相：甲醇(A)-2 mL·L-1甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(見表1)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：380 nm；進樣量：10 μL。

2.5液質聯用測定

2.5.1液質聯用高效液相條件 流動相為甲醇(A)-2 mL·L-1甲酸水溶液(B)；流速：0.25 mL·min-1；進樣量：3 μL；柱溫：40℃；檢測波長：380 nm。高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)洗脫條件見表1。

表1 乙酸乙酯層提取物流動相洗脫梯度Tab.1 Liquid phase elution gradient of ethyl acetate layer extract

2.5.2質譜條件 離子源：電噴霧雙噴離子源(dual AJS ESI)正、負離子模式；毛細管電壓：3 500 V；干燥氣溫度：350 ℃；流速：12 L·min-1；霧化氣電壓：40 Psi；掃描范圍m/z(100～1 000)。

3 結果

3.1桑黃中內生真菌的分離結果 應用反復劃線法，共分離得到12株內生真菌，菌落照片見圖1。在PDA培養基上28 ℃培養7 d后，于掃描電鏡低倍鏡(× 1 500)下觀察內生真菌菌絲體的細節，見圖2。由圖2可見，除SHM-1、SHTD-2和HHTD-3的菌絲體較為發達外，其余真菌產孢子量非常豐富，孢子大部分為球形，也有梭形和桿形。

圖1 野生桑黃子實體中內生真菌菌落的照片Fig.1 Photographs of endophytic fungi colonies in wild body of P.igniarius

圖2 內生真菌在掃描電鏡下的照片 (×1 500)Fig.2 Image of endophytic fungi under scanning electron microscope (×1 500)

3.2火木層孔菌的生長曲線 見圖3。由圖3可見，在培養火木層孔菌14～16 d時，其進入生長旺盛期，菌絲體干質量的最大值約為0.5 g，因此選擇該培養時間節點(15 d)加入生物誘導子，考察生物誘導子對火木層孔菌次生代謝的影響。

圖3 火木層孔菌的生長曲線Fig.3 Growth curve of P.igniarius

3.3生物誘導子對火木層孔菌次生代謝的影響 通過HPLC-二極管陣列檢測器(diode array detector，DAD)檢測發現，在380 nm(桑黃素類成分的最大吸收波長)處，火木層孔菌的次級代謝有3個主峰(見圖4)。經誘導子SHTD-4、HHTD-3、HHTD-2和SHM-2調控后的火木層孔菌的次級代謝變化較大(見圖5)，其中SHTD-4、HHTD-2和HHTD-3都使火木層孔菌次級代謝峰1的量增加而峰2和峰3的量有所下降，而用SHM-2誘導后，原峰1～3的含量均下降，在12 min之后出現一個新峰，通過與對照品做對照(見圖6)和應用電噴霧質譜(ESI-MS)負離子模式進行化合物結構分析(見圖7)，確定該峰為phelligridin G([M-H]-593.1779，分子式為C32H20O12，相對分子質量為594.474 3。

圖4 火木層孔菌次級代謝產物的HPLC圖注：1、2、3峰為火木層孔菌次級代謝產物。Fig.4 HPLC chromatograms of secondary metabolites of P.igniariusNotes:1,2,3 peaks were secondary metabolites of P.inniarius.

圖5 生物誘導子誘導火木層孔菌次級代謝產物的HPLC圖注：A.SHTD-4；B.HHTD-3；C.HHTD-2；D.SHM-2;1、2、3峰為火木層孔菌次級代謝產物。Fig.5 HPLC chromatograms of secondary metabolites of P.igniarius induced by biological elicitorNotes:A.SHTD-4；B.HHTD-3；C.HHTD-2；D.SHM-2;1,2,3 peaks were secondary metabolites of P.igniarius.

圖6 phelligridin G對照品的HPLC圖Fig.6 HPLC chromatogram of reference substance of phelligridin G

圖7 SHM-2誘導火木層孔菌后的質譜圖和結構注：A.液質色譜圖；B.二級質譜圖(負離子模式)。Fig.7 Mass spectrum and structure of P.igniarius induced by SHM-2Notes：A.chromatogram of HPLC-MS；B.secondary mass spectrum (negative ion mode).

4 討論

桑黃是具有抗腫瘤、提高免疫力等生物活性的藥食兩用真菌，隨著人們對保健的重視，藥食同源大型真菌的使用率也逐年上升。然而，桑黃的野生資源非常稀少，且栽培時間較長[13]，若想使其具有藥用價值一般需要栽培3年以上。因此，如何獲得與桑黃相似功能的藥用資源是當下科研工作需要解決的重要問題?；鹉緦涌拙巧｜S的基原菌種之一，其次級代謝產物包括多糖、倍半萜、三萜及hispidin等成分，與桑黃子實體的成分相似[6，14]，但在桑黃子實體中含量較高的hispidin衍生物在火木層孔菌中卻未發現，hispidin衍生物是桑黃具有抗氧化、抗癌及降血糖等活性的藥效物質基礎[2-5]。因此，如何改變火木層孔菌的次級代謝產物的代謝途徑、誘導火木層孔菌產生hispidin衍生物，從而能使其從藥用價值上代替桑黃子實體值得深入研究。查閱文獻發現，利用真菌誘導子和納米粒子等處理植物培養細胞以促使細胞快速、大量合成目的次生代謝產物的方法已被人們普遍重視[15-16]。真菌誘導子在植物細胞培養中應用較多，能顯著提高植物生物堿、紅厚殼素、白藜蘆醇、銀杏內酯B[17-19]等多種次生代謝產物的產量。本研究誘導火木層孔菌產生的phelligridin G是野生桑黃子實體中含有苯并吡喃酮結構的高度氧化的成分，對卵巢癌細胞(A2708)和人結直腸癌細胞(HCT-8)有選擇性細胞毒活性，對小鼠肝微粒體的脂質過氧化物酶有抑制活性[20]。本研究通過生物誘導法使火木層孔菌產生原本不能產生的hispidin衍生物phelligridin G，雖然產量低，但可為后續誘導機制的研究奠定關鍵的物質基礎，在此基礎上若能明確產生phelligridin G的關鍵催化酶，則可使大量生產該化合物成為可能。由此可見，在桑黃野生資源短缺、人工栽培難度大且具有藥用價值的桑黃生長年限長的情況下，生物誘導可為實現桑黃的資源開發和利用奠定物質基礎。