淫羊藿苷對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊細(xì)胞凋亡和Nrf2/ARE通路的影響

徐永艷，蘇 明，方笑涵，劉 暢，劉芃菲，趙曉濤(北京大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100044)

動(dòng)脈粥樣硬化是多種心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，以動(dòng)脈內(nèi)膜增厚、脂質(zhì)沉積、粥樣斑塊形成為特點(diǎn)，其中易損斑塊容易發(fā)生破裂并誘導(dǎo)血栓形成，與心肌梗死、腦梗死等心腦血管事件的發(fā)病密切相關(guān)[1-3]。血管平滑肌細(xì)胞的過度凋亡與凋亡基因中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3)的表達(dá)水平上升有關(guān)[4-5]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(anti-oxidative response element，ARE)通路是在心腦血管疾病中起重要作用的抗氧化通路，其也在細(xì)胞凋亡中起調(diào)控作用[6]。淫羊藿的有效成分淫羊藿苷具有保護(hù)作用，在肝臟、腎臟中均通過激活Nrf2/ARE通路減輕不同病理因素引起的組織損傷[7-8]。本研究將在載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型中研究淫羊藿苷對(duì)細(xì)胞凋亡及Nrf2/ARE通路的調(diào)控作用。

1 儀器與材料

1.1儀器 正置顯微鏡(日本Nikon公司)；凝膠電泳儀及成像儀(美國Bio-rad公司)。

1.2試藥 淫羊藿苷(美國Sigma公司)；HE檢測試劑盒、TUNEL檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Bax、Bcl-2、Caspase-3、Nrf2和ARE一抗均購自Abcam公司；MDA、8-OHdG和TAC檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3動(dòng)物 24只SPF級(jí)ApoE-/-小鼠[雄性、18～20 g，許可證SCXK(京)2016-0011]，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1動(dòng)物分組、造模及給藥 將ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和淫羊藿苷組，每組各8只。全部小鼠均腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，做頸正中切口、分離頸總動(dòng)脈，對(duì)照組不進(jìn)行其他操作，模型組和淫羊藿苷組在動(dòng)脈周圍植入內(nèi)徑0.3 mm的硅膠管，用6-0絲線固定，關(guān)閉切口。手術(shù)后，對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)及0.5 mL生理鹽水灌胃，1日1次，模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)及0.5 mL生理鹽水灌胃，1日1次，淫羊藿苷組給予高脂飼料喂養(yǎng)及100 mg·kg-1淫羊藿苷灌胃，1日1次。12周后進(jìn)行取材及檢測。

2.2血管病理改變的HE檢測 取小鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈，用石蠟包埋后制做病理切片，采用HE檢測試劑盒進(jìn)行染色，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，在顯微鏡下觀察血管的病理改變。

2.3血管平滑肌細(xì)胞凋亡的TUNEL檢測 取右側(cè)頸總動(dòng)脈的病理切片，采用TUNEL法試劑盒進(jìn)行染色，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，在顯微鏡下觀察TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算比值作為細(xì)胞凋亡率。

2.4Western blot檢測 取小鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈，加入裂解液后進(jìn)行勻漿，勻漿液在4 ℃條件下，以12 000 r·min-1離心10 min，分離上清進(jìn)行Western blot檢測。在聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)進(jìn)行電泳，而后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，NC)，NC在室溫下封閉。繼而經(jīng)一抗孵育(4 ℃)、二抗孵育(室溫)后在凝膠成像儀內(nèi)進(jìn)行顯影，得到目的蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、Nrf2、ARE及內(nèi)參蛋白β-actin的條帶，將目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為蛋白表達(dá)水平。

取右側(cè)頸總動(dòng)脈勻漿后的離心上清液，采用試劑盒檢測MDA、8-OHdG和TAC的水平，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

3 結(jié)果

3.13組小鼠血管病理改變的比較 如圖1所示，對(duì)照組小鼠頸動(dòng)脈的血管壁光滑，未出現(xiàn)粥樣斑塊；模型組小鼠頸動(dòng)脈血管壁內(nèi)可見斑塊沉積，且斑塊內(nèi)脂質(zhì)較大、斑塊結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定；淫羊藿苷組小鼠頸動(dòng)脈血管壁內(nèi)斑塊縮小且結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。

圖1 3組小鼠血管病理改變的比較(HE染色，×10)Fig.1 Comparison of vascular pathological changes among the 3 groups of mice (HE staining，×10)

3.23組小鼠血管平滑肌中細(xì)胞凋亡的比較 如圖2所示，對(duì)照組小鼠血管平滑肌細(xì)胞未見明顯凋亡，模型組和淫羊藿苷組小鼠血管平滑肌細(xì)胞的凋亡率分別為14.59%±3.23%和6.51%±1.59%。與對(duì)照組比較，模型組小鼠血管平滑肌中細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，淫羊藿苷組小鼠血管平滑肌中細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。

圖2 3組小鼠血管平滑肌中細(xì)胞凋亡的比較(TUNEL染色，×100)Fig.2 Comparison of apoptosis in vascular smooth muscle among the 3 groups (TUNEL staining，×100)

3.33組小鼠血管平滑肌中凋亡基因表達(dá)水平的比較 如圖3、表1所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血管平滑肌中Bax、Caspase-3的表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，淫羊藿苷組小鼠血管平滑肌中Bax、Caspase-3的表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。

表1 3組小鼠血管平滑肌中Bax、Bcl-2和Caspase-3表達(dá)水平的比較Tab.1 Comparison of Bax，Bcl-2 and Caspase-3 expression in vascular smooth muscle among the 3 groups of mice

圖3 3組小鼠血管平滑肌中Bax、Bcl-2和Caspase-3表達(dá)水平的Western blot檢測Fig.3 Results of Western blot detection of Bax，Bcl-2 and Caspase-3 expression in vascular smooth muscle of the 3 groups of mice

3.43組小鼠血管平滑肌中氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較 如表2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血管平滑肌中MDA、8-OHdG的水平明顯升高，TAC的水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，淫羊藿苷組小鼠血管平滑肌中MDA、8-OHdG的水平明顯降低，TAC的水平明顯升高(P<0.05)。

表2 3組小鼠血管平滑肌中MDA、8-OHdG和TAC的比較Tab.2 Comparison of MDA，8-OHdG and TAC in vascular smooth muscle among the 3 groups of mice

3.53組小鼠血管平滑肌中Nrf2/ARE通路的比較 如圖4、表3所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血管平滑肌中Nrf2、ARE的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，淫羊藿苷組小鼠血管平滑肌中Nrf2、ARE的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。

圖4 3組小鼠血管平滑肌中Nrf2、ARE表達(dá)水平的Western blot檢測結(jié)果Fig.4 Results of Western blot detection of Nrf2 and ARE expression in vascular smooth muscle of the 3 groups of mice

表3 3組小鼠血管平滑肌中Nrf2、ARE表達(dá)水平的比較 Tab.3 Comparison of Nrf2 and ARE expression in vascular smooth muscle among the 3 groups of mice

4 討論

動(dòng)脈粥樣硬化的特征是脂質(zhì)在血管壁沉積，引起巨噬細(xì)胞吞噬并泡沫化、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移。當(dāng)動(dòng)脈粥樣斑塊形成后，斑塊內(nèi)脂質(zhì)及纖維帽均會(huì)發(fā)生變化，斑塊內(nèi)脂質(zhì)核心增大、斑塊纖維帽變薄導(dǎo)致易損斑塊的形成，容易發(fā)生斑塊破裂并引起血栓形成，進(jìn)而造成心肌梗死、腦梗死等急性心腦血管事件的發(fā)生。因此，易損斑塊的臨床危害大，需要積極防治。近年關(guān)于易損斑塊形成的研究認(rèn)為，細(xì)胞凋亡是與斑塊穩(wěn)定性下降密切相關(guān)的生物學(xué)環(huán)節(jié)，血管平滑肌細(xì)胞的過度凋亡會(huì)造成斑塊內(nèi)形成壞死核心、引起斑塊纖維帽變薄，最終造成易損斑塊的形成[4-5]。本研究從細(xì)胞凋亡的角度分析易損斑塊的防治手段。

ApoE在脂質(zhì)代謝中起關(guān)鍵作用，敲除ApoE后給予高脂喂養(yǎng)是建立動(dòng)脈粥樣硬化模型的常用方法。王南丁等[9]的實(shí)驗(yàn)是在敲除ApoE及高脂喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上采用PCCP建立易損斑塊模型，本研究采用與王南丁等[9]相同的方法建立易損斑塊模型，通過HE染色觀察血管病理改變可知，動(dòng)脈壁內(nèi)脂質(zhì)斑塊沉積且斑塊內(nèi)脂質(zhì)核心較大、斑塊結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，符合易損斑塊的特征；通過TUNEL染色證實(shí)，模型組小鼠血管平滑肌出現(xiàn)了顯著的細(xì)胞凋亡，表明血管平滑肌細(xì)胞凋亡與易損斑塊的形成有關(guān)。

淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎等生物學(xué)作用。多項(xiàng)心血管疾病相關(guān)的研究證實(shí)，淫羊藿苷在心肌缺血再灌注損傷及內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過程中起抗凋亡的作用，能夠調(diào)控Bax和Bcl-2的表達(dá)，從而抑制線粒體途徑細(xì)胞凋亡[10-12]。Bax和Bcl-2在Caspase-3表達(dá)中分別起促進(jìn)和抑制作用，進(jìn)而能夠分別發(fā)揮抗凋亡和促凋亡的作用[13-14]。本研究在易損斑塊模型小鼠中檢測了線粒體途徑凋亡基因的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，Bax、Caspase-3的表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2的表達(dá)水平降低，表明在易損斑塊的形成過程中線粒體途徑凋亡發(fā)生了過度激活。在易損斑塊造模過程中給予淫羊藿苷灌胃干預(yù)后，小鼠血管平滑肌中的細(xì)胞凋亡率降低，促進(jìn)線粒體途徑凋亡的Bax、Caspase-3的表達(dá)水平也下降，抑制線粒體途徑凋亡的Bcl-2表達(dá)水平升高，表明將淫羊藿苷用于易損斑塊的治療能夠抑制線粒體途徑細(xì)胞凋亡。

在心血管疾病的發(fā)病過程中，平滑肌細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控與氧化應(yīng)激有關(guān)，自由基大量生成，一方面引起細(xì)胞的氧化損傷，造成MDA、8-OHdG等氧化產(chǎn)物的生成量增多[15-16]；另一方面通過調(diào)控下游NF-κB等途徑引起細(xì)胞凋亡[17-18]。本研究對(duì)易損斑塊形成過程中氧化應(yīng)激的分析顯示，MDA、8-OHdG的水平升高，TAC的水平降低；淫羊藿苷干預(yù)后，MDA、8-OHdG的水平降低，TAC的水平升高。這一結(jié)果表明氧化應(yīng)激與易損斑塊的形成有關(guān)，淫羊藿苷對(duì)氧化應(yīng)激具有抑制作用。Nrf2/ARE通路是重要的抗氧化通路，同時(shí)也具有抗凋亡作用[19-20]，本研究證實(shí)淫羊藿苷使易損斑塊模型小鼠血管平滑肌中Nrf2、ARE的表達(dá)量增加，提示淫羊藿苷的抗凋亡及抗氧化作用與激活Nrf2/ARE通路有關(guān)。

綜上所述，淫羊藿苷能夠改善ApoE-/-小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊，這與抑制細(xì)胞凋亡及Nrf2/ARE通路有關(guān)，未來淫羊藿苷有望成為防治易損斑塊、治療心腦血管疾病的潛在藥物。