ABCG2抑制劑對ALA-PDT誘導皮膚癌細胞凋亡的影響

柳喜鳳，張東晨(.河北省保定市第一中心醫院公共衛生科，保定 07000；2.河北省保定市第一中心醫院皮膚科，保定 07000)

皮膚癌是臨床常見疾病，在長期受到紫外線照射或吸煙人群中的發病率較高[1]。皮膚癌的長期進展會影響患者的外貌，還導致患者病死率升高，嚴重影響患者的生活質量[2]。手術治療能顯著提高皮膚癌患者的生存率，但對于腫瘤病灶大、位置特殊的患者，術后創傷形成的瘢痕會給患者帶來強烈的精神痛苦[3]。5-氨基乙酰丙酸(5-aminolaevulinic acid，5-ALA)是新一代的光敏感劑，可導致細胞中原卟啉IX(protoporphyrin IX，PPIX)蓄積[4]。光動力療法(photodynamic therapy，PDT)是一種以光、光敏劑和氧分子相互作用為基礎的非侵襲性治療技術，可選擇性破壞靶細胞、組織，還具有一定美容效果[5]。研究發現，病變部位PPIX的蓄積是影響ALA-PDT療效的重要因素[6]。而三磷酸腺苷結合轉運蛋白G超家族成員2(ATP-binding cassette transporter group 2，ABCG2)可調節內源性PPIX水平，過度表達會引起胞內PPIX水平降低[7]。ABCG2抑制劑可恢復三陰性乳腺癌細胞對ALA-PDT的敏感性[8]。但ABCG2抑制劑對ALA-PDT治療皮膚癌的影響尚鮮有研究。本研究將探討ABCG2抑制劑Ko-143對ALA-PDT誘導不同皮膚癌細胞凋亡的影響，以期為提高ALA-PDT對皮膚癌的療效提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 恒溫培養箱(型號TY10GI2-2，美國Shellab公司)；酶標儀(型號Stat Fax-2100，美國Awareness公司)；流式細胞儀(型號Guauasoft 6L，美國Millipor公司)；凝膠成像儀(型號GelDocEZ，美國Bio-Rad公司)。

1.2試藥 人皮膚基底癌細胞TE354.T、人皮膚鱗癌細胞SCL-1(貨號HTX2117C、HTX2657C，深圳市豪地華拓生物科技有限公司)；5-ALA(貨號YJ3004833，上海一基實業有限公司)；ABCG2抑制劑Ko-143(貨號A11475，美國Adooq Bioscience公司)；RPMI-1640培養液(貨號CP680110A，上海冠導生物工程有限公司)；MTT試劑盒(貨號M1020，北京索萊寶科技有限公司)；Annexin-V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(貨號SNM530-FNI)，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)檢測試劑盒(貨號ARB10949)，丙二醛(malonydialdehyed，MDA)檢測試劑盒(貨號ARB12124)，均購自北京百奧萊博科技有限公司；PPIX抗體(貨號ab235595)，ABCG2抗體(貨號ab229193)，B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體(貨號ab32124)，Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體(貨號ab182734)，活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3)抗體(貨號ab49822)，GAPDH抗體(貨號ab59164)，羊抗兔lgG(貨號 ab205718)，均購自Abcam公司。

2 方法

2.1細胞培養 TE354.T、SCL-1細胞解凍復蘇后，培養于含質量濃度為1 g·L-1胎牛血清的RPMI-1640培養液中，培養皿放在37℃、體積分數為5%的二氧化碳培養箱中，1～2 d更換1次培養液，待細胞覆蓋培養皿底部80%左右時，用質量濃度為0.025 g·L-1的胰酶消化成單個細胞傳代，取對數期細胞進行后續實驗。

2.2MTT法檢測TE354.T和SCL-1細胞增殖 取對數期TE354.T、SCL-1細胞，使用培養液將細胞懸液的密度調整為1×105個·mL-1，以每孔100 μL細胞懸液接種于96孔培養板。設置對照組、ALA-PDT組、Ko-143組和ALA-PDT+Ko-143組，每組6個復孔。對照組細胞不進行干預；ALA-PDT組細胞加入終濃度為2 mmol·L-1的5-ALA，避光孵育4 h，進行光照密度為10 J·cm-2(20 mW·cm-2，500 s)的PDT處理[9]；Ko-143組加入終濃度為10 μmol·L-1的ABCG2抑制劑Ko-143[10]；ALA-PDT+Ko-143組加入終濃度為2 mmol·L-1的5-ALA及終濃度為10 μmol·L-1的Ko-143，避光孵育4 h，進行光照密度為10 J·cm-2(20 mW·cm-2，500 s)的ALA-PDT處理。處理結束后放回培養箱中再孵育20 h，每孔加入3-(4，5)-2-噻唑-(2，5)-二苯基溴化四氮唑藍[3-(4，5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]10 μL，放回培養箱中繼續孵育4 h，棄去培養液，每孔加二甲基亞砜(dimethylsurfoxide，DMSO) 150 μL，避光振蕩溶解，測定各孔450 nm處的吸光度(A)，計算增殖抑制率。增殖抑制率=[(A對照組-A實驗組)/A對照組]×100%。

2.3流式細胞術檢測TE354.T和SCL-1細胞凋亡 取對數期TE354.T、SCL-1細胞，使用培養液調整細胞懸液的密度為1×105個·mL-1，以每孔500 μL細胞懸液接種于24孔培養板，按2.2項下方法對細胞進行分組和處理。處理結束后，放回培養箱中孵育20 h，收集細胞，經胰酶消化后洗滌。將Annexin-VFITC、PI和結合緩沖液按1∶2∶50配制成Annexin-V-FITC/PI染液，使用Annexin-V-FITC/PI染液將細胞重懸，使其成為密度為1×107個·mL-1的細胞懸液，室溫避光孵育15 min，在流式細胞儀上樣，檢測細胞凋亡率。

2.4ELISA法檢測TE354.T和SCL-1細胞中的GSH-Px活性、MDA含量 取對數期TE354.T、SCL-1細胞，使用培養液將細胞懸液的密度調整為1×105個·mL-1，以每孔500 μL細胞懸液接種于24孔培養板，按2.2項下方法進行分組和處理。處理結束后，放回培養箱中孵育20 h。收集細胞，經消化后洗滌，在冰上將細胞制成勻漿后離心，取上清，參照ELISA試劑盒說明書中步驟，測定450 nm處各組樣品與標準物的A值，用標準物濃度及相應A值繪制標準曲線，計算TE354.T、SCL-1細胞中GSH-Px的活性和MDA的含量。

2.5蛋白印跡法檢測TE354.T和SCL-1細胞中PPIX、ABCG2、Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達 取對數期TE354.T、SCL-1細胞，使用培養液將細胞懸液的密度調整為1×105個·mL-1，以每孔500 μL細胞懸液接種于24孔培養板，按2.2項下方法進行分組和處理。處理結束后，放回培養箱中孵育20 h，收集細胞并用裂解液裂解，提取總蛋白并測定濃度，取適量樣本，加Buffer緩沖液并用沸水浴處理，使其變性，經凝膠電泳分離、半干法轉膜和脫脂奶粉封閉后，加入按1∶800稀釋的一抗(PPIX抗體、ABCG2抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體、Cleaved caspase-3抗體和GAPDH抗體)，4℃孵育過夜，用TBST洗滌3次(10 min·次-1)，加入按1∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h，用TBST洗滌3次，增強化學發光法(enhanced chemiluminescence，ECL)發光顯色，凝膠成像儀采集圖片，用Image J軟件分析灰度值。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參GAPDH灰度值。

3 結果

3.1Ko-143對ALA-PDT誘導TE354.T和SCL-1細胞增殖抑制的影響 與對照組相比，ALA-PDT組和Ko-143組TE354.T、SCL-1細胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05)；與ALA-PDT組相比，ALA-PDT+Ko-143組TE354.T、SCL-1細胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組TE354.T和SCL-1細胞增殖抑制率比較Tab.1 Comparison of proliferation inhibition rates of TE354.T and SCL-1 cells in each group

3.2Ko-143對ALA-PDT誘導TE354.T和SCL-1細胞凋亡的影響 與對照組相比，ALA-PDT組和Ko-143組TE354.T、SCL-1細胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)；與ALA-PDT組相比，ALA-PDT+Ko-143組TE354.T、SCL-1細胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)。見圖1和表2。

表2 各組TE354.T和SCL-1細胞凋亡率比較Tab.2 Comparison of apoptosis rate of TE354.T and SCL-1 cells in each group

圖1 各組TE354.T和SCL-1細胞凋亡情況Fig.1 Apoptosis of TE354.T and SCL-1 cells in each group

3.3Ko-143對ALA-PDT誘導TE354.T和SCL-1細胞氧化應激的影響 與對照組相比，ALA-PDT組和Ko-143組TE354.T、SCL-1細胞中GSH-Px活性均顯著降低，MDA含量均顯著升高(P<0.05)；與ALA-PDT組相比，ALA-PDT+Ko-143組TE354.T、SCL-1細胞中GSH-Px活性均顯著降低，MDA含量均顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組TE354.T、SCL-1細胞中GSH-Px活性和MDA含量比較 Tab.3 Comparison of GSH-Px activity and MDA content in TE354.T and SCL-1 cells in each group

3.4Ko-143對ALA-PDT誘導TE354.T和SCL-1細胞中ABCG2和PPIX蛋白表達的影響 與對照組相比，ALA-PDT組TE354.T、SCL-1細胞中ABCG2的表達水平差異均無統計學意義(P>0.05)，PPIX蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)；Ko-143組TE354.T、SCL-1細胞中ABCG2蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，PPIX蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)。與ALA-PDT組相比，ALA-PDT+Ko-143組TE354.T、SCL-1細胞中ABCG2蛋白表達水平均顯著降低，PPIX蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)。見圖2和表4。

圖2 各組TE354.T和SCL-1細胞中ABCG2和PPIX的蛋白表達水平

表4 各組TE354.T、SCL-1細胞中ABCG2和PPIX蛋白表達水平比較Tab.4 Comparison of ABCG2 and PPIX protein expression levels in TE354.T and SCL-1 cells in each group

3.5Ko-143對ALA-PDT誘導TE354.T和SCL-1細胞中凋亡相關蛋白表達的影響 與對照組相比，ALA-PDT組、Ko-143組TE354.T、SCL-1細胞中Bcl-2/Bax蛋白的表達水平均顯著降低(P<0.05)，Cleaved caspase-3蛋白的表達水平均顯著升高(P<0.05)。與ALA-PDT組相比，ALA-PDT+Ko-143組TE354.T、SCL-1細胞中Bcl-2/Bax蛋白的表達水平均顯著降低，Cleaved caspase-3蛋白的表達水平均顯著升高(P<0.05)。見表5和圖3。

表5 各組TE354.T、SCL-1細胞中Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達水平比較Tab.5 Comparison of the expression levels of Bcl-2，Bax and cleaved caspase-3 in TE354.T and SCL-1 cells in each group

圖3 各組TE354.T和SCL-1細胞中Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3蛋白的表達水平注：A～D分別為TE354.T細胞對照組、ALA-PDT組、Ko-143組和ALA-PDT+Ko-143組；E～H分別為SCL-1細胞對照組、ALA-PDT組、Ko-143組和ALA-PDT+Ko-143組。Fig.3 Expression of Bcl-2，Bax，cleaved caspase-3 in TE354.T and SCL-1 cells in each groupNotes:A-D were control group，ALA-PDT group，Ko-143 group and ALA-PDT+Ko-143 group of TE354.T cell，respectively; E-H were control group，ALA-PDT group，Ko-143 group and ALA-PDT+Ko-143 group of SCL-1 cell，respectively.

4 討論

皮膚是最大的人體器官，能夠保護機體免于發生物理損傷，然而，皮膚在長時間的紫外線或輻射等的照射下，會出現皮膚組織細胞中DNA的斷裂，引起皮膚癌變[11]。皮膚基底細胞癌、皮膚鱗狀細胞癌是分別由多能性基底樣細胞、表皮角質形成細胞異常增生而形成的腫瘤，在惡性皮膚腫瘤中的發病率居前兩位，近年來其發病率不斷升高[12]。目前治療皮膚癌的方法有很多，如手術、激光、冷凍、放療和化療等，其中手術治療療效顯著，為首選治療方案，但其在治療某些特殊患者時具有很大的局限性，存在創面大、遺留疤痕、不良反應多和美容效果欠佳等缺點[13]。因此，尋找更合適的治療手段對于皮膚癌的治療具有重要意義。

ALA-PDT是新興起的皮膚腫瘤的治療方式，近年來，由于其具有創傷小、痛苦少、無皮損部位限制等優勢，在皮膚淺表腫瘤的治療中逐漸得到廣泛應用。PDT是通過特定波長的激光激活光敏劑，同時與分子氧發生作用，從而產生活性氧分子，通過氧化作用導致細胞膜或蛋白質發生氧化損傷，進而導致細胞死亡[14]。5-ALA是一種血紅蛋白合成中間物，在體內的量較少，但某些代謝旺盛的腫瘤細胞可選擇性吸收、積累進入體內的外源性5-ALA[15]。5-ALA被腫瘤細胞吸收后代謝為內源性光敏劑PPIX，具有強光敏作用，在特定波長激光的照射下會被激活生成單態氧，進而殺傷細胞，達到治療腫瘤的目的[13，16]。因此，ALA-PDT對腫瘤細胞的殺傷作用與腫瘤細胞中PPIX的蓄積水平有關。本研究顯示，ALA-PDT可以顯著提高TE354.T、SCL-1細胞的增殖抑制率及凋亡率，并降低Bcl-2/Bax蛋白的表達水平，提高Cleaved caspase-3蛋白的表達水平，提示ALA-PDT可以下調抑凋亡成員Bcl-2與促凋亡成員Bax的比值，并提高caspase-3活性，抑制皮膚基底細胞癌TE354.T細胞、皮膚鱗狀細胞癌SCL-1細胞增殖并誘導其凋亡。GSH-Px是重要的抗氧化酶，可阻止脂質過氧化反應，保護細胞膜的結構和功能，而MDA作為脂質過氧化反應的最終產物，是檢測氧化應激反應的重要參考指標[17]。本研究顯示，ALA-PDT可以顯著提高TE354.T、SCL-1細胞中PPIX蛋白的水平及MDA的含量，降低GSH-Px的活性，提示ALA-PDT會導致TE354.T、SCL-1細胞中PPIX蛋白蓄積，進而提高氧化應激反應，導致TE354.T、SCL-1細胞發生氧化應激損傷并凋亡。

ABCG2是ABC轉運蛋白家族成員，在腫瘤中普遍高表達，其會主動將化療藥物泵出細胞外，導致癌細胞耐藥[18]。孫偉等[19]研究表明，ABCG2介導惡性腦膠質瘤細胞內PPIX的外流，使用白藜蘆醇抑制ABCG2的表達可增加細胞內PPIX的含量，從而提高PDT療效。Ko-143是一種有效且具有相對選擇性的ABCG2抑制劑，是ABCG2特異性抑制劑煙曲霉毒素C(fumitremorgin C，FTC)的衍生物，對ABCG2的抑制作用是FTC的10倍[10]。本研究顯示，使用Ko-143輔助ALA-PDT處理TE354.T、SCL-1細胞后，細胞中ABCG2蛋白的表達水平均顯著降低，同時PPIX蛋白的表達水平均顯著升高，提示Ko-143在顯著抑制ABCG2蛋白表達的同時，還能夠使PPIX在胞內蓄積。同時，與ALA-PDT組相比，ALA-PDT+Ko-143組TE354.T、SCL-1細胞中GSH-Px的活性及Bcl-2/Bax蛋白的表達水平顯著降低，MDA含量及Cleaved caspase-3蛋白的表達水平顯著升高，細胞增殖抑制率及凋亡率均顯著升高，提示Ko-143抑制ABCG2蛋白表達后，可提高ALA-PDT作用下細胞內PPIX蛋白的蓄積量，導致細胞氧化應激反應加劇，提高ALA-PDT對TE354.T、SCL-1細胞增殖的抑制及對凋亡的促進能力。

綜上所述，ABCG2抑制劑Ko-143能抑制ABCG2的表達，提高PPIX蛋白在胞內的蓄積水平，對ALA-PDT誘導TE354.T、SCL-1細胞氧化應激損傷和凋亡具有促進作用，對臨床減少ALA-PDT抵抗、提高ALA-PDT療效可能具有一定價值。