芪明顆粒對糖尿病視網膜病變大鼠炎癥反應的改善作用及機制

潘艷杰，張海濤，查俊華，段 柯，劉向玲(.鄭州頤和醫院眼科，鄭州 450000；.河南省人民醫院眼科，鄭州 450000；.鄭州大學第二附屬醫院眼科，鄭州 450000)

糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病(DM)最常見的微血管并發癥，也是成人視力喪失的主要原因，嚴重危害人類的視力健康[1]。通過早期篩查，及早控制血糖，采用藥物干預，對于減緩DR發展、維持視力具有積極意義。芪明顆粒(QM)是臨床實踐中研究出的一種新藥，具有益氣生津、滋肝養腎、通絡明目的功效；主治肝腎不足、氣陰兩虧、目絡瘀滯等癥[2-3]。QM采用辨證分型，分期論治，能夠減輕視網膜損傷，改善視網膜病變，臨床上用于治療DR，療效確切[4]。但其具體作用機制研究較少，本研究通過觀察其對DR大鼠炎癥的改善作用探討其可能的機制，為臨床應用該藥治療DR提供實驗依據。

1 儀器、材料與方法

1.1儀器與材料

1.1.1儀器 YZ5E裂隙燈和手持檢眼鏡，均購自蘇州六六視覺科技股份有限公司；One touch血糖儀和血糖試紙，均購自美國強生Lifescan公司；Mini-Protean4電泳儀，購自美國BioRad公司。

1.1.2試藥 鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)；芪明顆粒(國藥準字Z20090036，浙江萬晟藥業有限公司，規格：4.5 g×15袋)；大鼠白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和C反應蛋白(CRP)酶聯免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒，均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；多聚甲醛、二甲苯和乙醇，均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；戊巴比妥鈉(上海紫一試劑廠)；電化學發光(ECL)試劑盒[翌圣生物科技(上海)股份有限公司]；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖鹽溶液(TBS,上海源葉生物科技有限公司)；二喹啉甲酸(BCA,蛋白檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司)；兔抗大鼠高遷移率族蛋白1(HMGB-1)多抗(美國Cell Signaling Technology公司);兔抗大鼠Toll樣受體4(TLR4)多抗、核轉錄因子κB(NF-κB)多抗、B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)和末端脫氧核糖核苷酸轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)凋亡試劑盒,均購自美國Abcam公司。

1.1.3實驗動物 SPF級SD大鼠55只，雄性，8周齡，體質量為(200±20) g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，生產許可證號：SCXK(京)2016-0006。購入后保持相對濕度為60%±10%，溫度為(23±1) ℃，適應性飼養7 d。

1.2方法

1.2.1建模、分組及干預 取100 mg STZ，用0.1 mol·L-1檸檬酸鈉溶解，4 ℃保存備用。隨機取45只大鼠，禁食不禁水12 h后，采用一次腹腔注射STZ溶液(60 mg·kg-1)誘導DM模型，72 h后，尾靜脈測血糖，以血糖值≥16.7 mmol·L-1為建模成功，繼續飼喂12周，每周測量大鼠血糖值，考察血糖穩定性。將40只成模DM大鼠隨機分為DR組、QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對照組，每組10只。按照人與大鼠體表面積折算給藥劑量，QM低劑量組和QM高劑量組分別按1.2、2.4 g·kg-1灌胃QM，陽性對照組按照40 mg·kg-1灌胃辛伐他汀，DR組灌胃等體積生理鹽水。剩余10只大鼠作為對照組，灌胃等體積生理鹽水。所有大鼠干預頻次：每日1次，連續6周。

1.2.2檢測血清炎癥因子水平 末次給藥后12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉大鼠，腹腔靜脈采血5 mL，以3 000 r·min-1離心10 min，離心半徑為10 cm，取上清，采用ELISA法測定血清中IL-6、TNF-α和CRP水平，經包被、洗滌、封閉、加樣、顯色和終止反應后，在450 nm波長處用酶標儀測定吸光度值A，根據標準曲線測定樣品中IL-6、TNF-α和CRP水平。

1.2.3HE染色觀察視網膜病變 采血完畢后處死大鼠，摘取雙側眼球，分離左側視網膜，于體積分數為4%的多聚甲醛中固定24 h，采用梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟、包埋，切片機連續切片，片厚約3 μm，常規HE染色后，滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片，鏡檢。

1.2.4TUNEL法檢測細胞凋亡 取視網膜切片，常規脫蠟，用酒精水化，用體積分數為3%的過氧化氫封閉5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)緩沖液濕盒37 ℃反應60 min，抗地高辛抗體濕盒反應30 min，免疫組織化學(SABC)法染色，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，脫水、透明后進行封片。鏡下觀察計數視網膜神經節細胞(RGCs)凋亡數，每張切片隨機選取5個視野，計算凋亡指數。凋亡指數=凋亡細胞數÷細胞總數×100%。

1.2.5Wetern Blot檢測視網膜蛋白表達 分離右側視網膜，保存于液氮中。取視網膜80 mg，加入裂解液，離心取上清，BCA法測定樣品中蛋白含量，加入5倍上樣緩沖液，沸水煮5 min使蛋白變性失活，進行SDS-PAGE電泳，蛋白轉移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗，稀釋比例：Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、HMGB1(1∶1 000)、TLR4(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜，TBS溶液洗膜3次，加入HRP標記的相應二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，TBS溶液洗膜3次，加入ECL發光液，曝光、顯影，分析數據，比較各條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達水平，以目的條帶灰度值/內參條帶灰度值表示。

2 結果

2.1治療前后血糖比較 與對照組比較，DR組、QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對照組治療前、治療后血糖水平均升高(P<0.05)；與DR組比較，QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對照組治療后血糖水平降低(P<0.05)；與QM低劑量組比較，QM高劑量組和陽性對照組治療后血糖水平降低(P<0.05)。DR組、QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對照組治療前血糖水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；QM高劑量組和陽性對照組治療后血糖水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 血糖水平比較Tab.1 Comparison of blood sugar levels

2.2血清IL-6、TNF-α和CRP水平比較 與對照組比較，DR組、QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對照組血清IL-6、TNF-α和CRP水平均升高(P<0.05)；與DR組比較，QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對照組血清IL-6、TNF-α和CRP水平均降低(P<0.05)；與QM低劑量組比較，QM高劑量組和陽性對照組血清IL-6、TNF-α和CRP水平均降低(P<0.05)；QM高劑量組和陽性對照組血清IL-6、TNF-α和CRP水平比較差異無統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 血清IL-6、TNF-α和CRP水平比較Tab.2 Comparison of serum IL-6，TNF-α and CRP levels

2.3HE染色觀察視網膜病理學變化 對照組視網膜結構完整，分層清楚，各層細胞排列緊密，RGCs數量較多，形狀規則，排列整齊；DR組視網膜結構破壞，RGCs數量減少，部分細胞可見空泡樣變性，出現異形細胞，內核層、外核層細胞排列紊亂，數量減少；QM各劑量組及陽性對照組視網膜結構較DR組有所改善，各層細胞排列較規則，RGCs異形細胞減少，內核層和外核層細胞排列較規則，數量較多，其中QM高劑量組和陽性對照組改善效果明顯。見圖1。

圖1 視網膜病理學變化注：A.對照組；B.DR組；C.QM低劑量組；D.QM高劑量組；E.陽性對照組；HE×400。Fig.1 Pathological changes of the retinaNotes：A.control group;B.DR group;C.QM low-dose group;D.QM high-dose group;E.positive control group;HE×400.

2.4RGCs凋亡指數比較 對照組、DR組、QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對照組RGCs凋亡指數分別為3.24%±0.75%、22.56%±1.52%、11.27%±1.14%、7.67%±1.07%、7.16%±1.18%。與對照組比較，DR組、QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對照組凋亡指數均升高(P<0.05)；與DR組比較，QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對照組凋亡指數均降低(P<0.05)；與QM低劑量組比較，QM高劑量組和陽性對照組凋亡指數均降低(P<0.05)；QM高劑量組和陽性對照組凋亡指數比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 RGCs凋亡情況注：A.對照組；B.DR組；C.QM低劑量組；D.QM高劑量組；E.陽性對照組；TUNEL×400。Fig.2 Apoptosis of RGCsNotes：A.control group;B.DR group;C.QM low-dose group;D.QM high-dose group;E.positive control group;TUNEL×400.

2.5視網膜中凋亡相關蛋白水平比較 與對照組比較，DR組、QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對照組視網膜中Bcl-2蛋白表達和Bcl-2/Bax均降低，Bax蛋白表達升高(P<0.05)；與DR組比較，QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對照組視網膜中Bcl-2蛋白表達和Bcl-2/Bax升高，Bax蛋白表達降低(P<0.05)；與QM低劑量組比較，QM高劑量組和陽性對照組視網膜中Bcl-2蛋白表達和Bcl-2/Bax升高，Bax蛋白表達降低(P<0.05)；QM高劑量組和陽性對照組視網膜中Bcl-2、Bax和Bcl-2/Bax比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3和圖3。

圖3 視網膜中Bcl-2、Bax蛋白表達注：A.對照組；B.DR組；C.QM低劑量組；D.QM高劑量組；E.陽性對照組。Fig.3 Bcl-2 and Bax protein expression in the retinaNotes：A.control group;B.DR group;C.QM low-dose group;D.QM high-dose group;E.positive control group.

表3 視網膜中Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax水平比較Tab.3 Comparison of Bcl-2，Bax，Bcl-2/Bax levels in the retina n=10)

2.6視網膜中HMGB1/TLR4/NF-κB通路相關蛋白水平比較 與對照組比較，DR組、QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對照組視網膜中HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達升高(P<0.05)；與DR組比較，QM低劑量組、QM高劑量組和陽性對照組視網膜中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達降低(P<0.05)；與QM低劑量組比較，QM高劑量組和陽性對照組視網膜中HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達均降低(P<0.05)；QM高劑量組和陽性對照組視網膜中HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4和圖4。

表4 視網膜中HMGB1、TLR4和NF-κB水平比較Tab.4 Comparison of HMGB1，TLR4 and NF-κB levels in the retina

圖4 視網膜中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達注：A.對照組；B.DR組；C.QM低劑量組；D.QM高劑量組；E.陽性對照組。Fig.4 HMGB1，TLR4 and NF-κB protein expression in the retinaNotes：A.control group;B.DR group;C.QM low-dose group;D.QM high-dose group;E.positive control group.

3 討論

DR的主要病理學變化表現為RGCs凋亡、視網膜神經功能障礙和新生血管生成等[5-6]。發生DM后，血糖控制不佳，視網膜血流動力學發生改變，導致視網膜局部缺氧，IL-6、TNF-α和CRP表達增加，引起血管內皮生長因子表達，進而導致炎癥反應，炎性細胞大量浸潤，視網膜結構和功能遭到破壞，最終形成DR[7-8]。DR的發生、發展與炎癥密切相關，大量抗炎治療實驗結果表明，降低炎癥反應能有效抑制DR發展[9-11]。

單純控制血糖不能完全阻止DR發展，需要通過藥物治療。中醫認為，DM屬于“消渴病”范疇，因消渴引起眼部功能改變，導致視力降低甚至喪失，證見頭暈耳鳴、目睛干澀和視物昏花等[12]。DR的基本病機為氣陰兩虛、肝腎不足，因虛致淤導致目絡阻滯，治療該病應補氣生津、滋養肝腎，標本兼治[13-14]。QM是臨床實踐研制的一種新藥，由黃芪、葛根、地黃、枸杞、決明子、茺蔚子、蒲黃和水蛭8種中藥制成，有滋肝養腎、益氣活血作用。黃芪益氣升陽、活血化瘀，葛根生津止渴、清熱涼血，二者合用益氣生津，補而不滯，共為君藥。地黃滋陰養血，枸杞補肝明目，為臣藥，輔助君藥益氣養陰。決明子明目助眠，茺蔚子活血補陰，蒲黃通淋化瘀，水蛭破血逐淤，諸藥合用，共奏活血止血、祛瘀生新、清熱明目之功效。李云等[15]研究表明，QM聯合百令膠囊用于早期慢性腎臟病，可抑制炎癥反應，改善腎功能。王軍媛等[16]研究顯示，QM治療糖尿病腎病早期患者，炎癥因子水平及尿蛋白明顯低于對照組，療效確切。本研究采用QM治療DR大鼠，血糖水平及IL-6、TNF-α和CRP等炎癥因子水平明顯降低，RGCs細胞凋亡減少，視網膜結構有所改善，且QM高劑量組與陽性藥物效果相當，提示QM治療DR大鼠能減少炎癥反應，保護視網膜結構和功能。

HMGB1是炎癥反應的重要介質，當機體受到創傷或應激等刺激時，誘導機體產生HMGB1，募集活化免疫細胞，激活機體免疫系統[17]。HMGB1可作為TLR4的內源性配體，釋放到胞外后通過與TLR4結合，激活下游NF-κB，誘導炎癥反應。臨床研究顯示，HMGB1/TLR4/NF-κB通路在糖尿病腎病患者中高表達，其釋放的炎癥因子能夠促進級聯炎癥反應，進一步加重糖尿病視網膜病變[18-19]。實驗性腦外傷大鼠中，小膠質細胞激活誘導的炎癥反應可通過阻滯HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路得到抑制[20]。另外，有研究證實，HMGB1在多種疾病中表達顯著升高，本研究中，DR組HMGB1、TLR4和NF-κB表達較對照組明顯升高，提示HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路參與DR的發生、發展，經QM治療后，Bcl-2表達及Bcl-2/Bax升高，Bax表達降低，HMGB1、TLR4和NF-κB表達降低，且QM高劑量組與陽性對照組效果相當，提示QM可能通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路，減輕炎癥反應，減少RGCs凋亡，保護視網膜。

綜上所述，QM可改善DR大鼠的炎癥反應，減少RGCs凋亡，可能是通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路發揮抗炎作用，為臨床治療DR奠定了基礎。