坎格列凈納米晶體凍干粉的制備及其藥動學和藥效學評價

劉 佳，吉 莉，陳 潔，黃雅菲(南京市溧水區人民醫院藥劑科，南京 211200)

坎格列凈(CFZ)屬于鈉-葡萄糖共轉運蛋白-Ⅱ(SGLT Ⅱ)抑制劑[1-2]，用于治療2型糖尿病，其作用機制是通過抑制腎臟的近曲小管SGLT-Ⅱ的活性從而抑制葡萄糖重吸收，達到降血糖的目的[3-4]。CFZ屬于生物藥劑學分類系統(BCS)Ⅳ類藥物，水溶性和滲透性均較差，具有肝臟首過效應，且是P糖蛋白(P-gp)的底物，這些因素導致了CFZ口服生物利用度較低[5-6]。納米晶體(NCs)是由藥物和穩定劑構成的納米或亞微米級膠體水分散體，在增加難溶藥物的溶解度和口服生物利用度方面受到廣泛關注[7-8]。本研究以維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)和十二烷基硫酸鈉(SDS)作為穩定劑，采用高壓均質法將CFZ制備成納米晶體(CFZ-NCs)[9-10]，冷凍干燥成固體粉末，并通過大鼠體內藥動學評估藥物生物利用度和控制血糖的效果，為CFZ的口服新劑型研究提供依據。

1 儀器與材料

1.1儀器 DRS2000型高速高剪切乳化分散機(德國IKA公司)；APV-2000型超高壓均質機(德國APV公司)；Malvern Zetasizer Nano ZSE 納米粒度電位儀(英國馬爾文公司)；Regulus8100冷場發射掃描電鏡(日本日立公司)；RC-8MD智能溶出試驗儀(天津市精拓儀器科技有限公司)；LGJ-20F冷凍干燥機(北京松源華興科技發展有限公司)。

1.2試藥 坎格列凈原料藥(CFZ,連云港潤眾制藥有限公司，批號110601，質量分數≥99.8 %)；聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯(TPGS，北京中生瑞泰科技有限公司)；十二烷基硫酸鈉(SDS，西格瑪奧德里奇上海貿易有限公司)；甘露醇(法國羅蓋特公司)；水為純化水。

1.3實驗動物 Wistar大鼠，SPF級，雌雄各半，體質量為(220±20) g，由江蘇衛生健康職業學院提供，動物許可證號：SYXK(蘇)2020-0001。

2 方法與結果

2.1CFZ-NCs及其凍干粉的制備 以TPGS和SDS聯合使用作為穩定劑[11-12]，采用高壓均質法制備CFZ-NCs，并通過冷凍干燥工藝將其固化成固體粉末[13]。制備工藝：使用高速粉碎機將CFZ原料藥初步粉碎，原料藥粒徑分布D90(累積分布為90%的粒徑)約為20 μm；取上述CFZ原料藥5 g加入到介質溶液100 mL中(含有TPGS的質量濃度為5 mg·mL-1，SDS質量濃度為1 mg·mL-1)，攪拌分散均勻，通過高速剪切分散乳化機(剪切速度為10 000 r·min-1)剪切分散10 min，得到CFZ初級混懸液；再將該混懸液通過高壓均質機均質處理(均質壓力為800 bar，均質5次)，即得到CFZ-NCs，備用；向CFZ-NCs中加入甘露醇(質量濃度為5 mg·mL-1)，分裝到西林瓶中進行冷凍干燥，凍干后加塞密封保存，即得到CFZ-NCs凍干粉。

2.2CFZ-NCs及其凍干粉的質量評價

2.2.1粒徑、Zeta電位測定 取新制備的CFZ-NCs以及本批樣品的凍干粉末，分別加入純化水復溶、稀釋，使其分散均勻，分別取上述樣品置于聚苯乙烯樣品池中，通過Malvern Zetasizer Nano ZSE 納米粒度電位儀測定粒徑分布和Zeta電位(光源：HE-NE激光器，波長:632.8 nm，90°散射角，溫度：25 ℃)，結果見表1。

由表1可知，CFZ-NCs在凍干前的粒徑為(281.7±15.5) nm，多聚分散指數(PDI)為(0.258±0.009)，粒度分布較窄，可減輕藥物納米晶體的奧斯瓦爾德熟化現象[14]，有利于CFZ-NCs的穩定性；CFZ-NCs在凍干前的Zeta電位為(-36.1±1.0)mV，其絕對值大于30 mV，靜電排斥力足夠大，可有效防止納米晶體之間相互聚集[15]；CFZ-NCs在凍干后，其粒徑分布和Zeta電位均未發生明顯變化，說明CFZ-NCs經冷凍干燥后未發生聚集。

表1 CFZ-NCs凍干前后的理化性質Tab.1 The physical and chemical properties of CFZ-NCs before and after lyophilization

2.2.2微觀結構 由圖1可知，CFZ-NCs加入純化水稀釋，取1滴樣品均勻鋪展到錫箔紙表面，在紅外燈下進行干燥，采用導電膠帶將樣品黏附在樣品臺上，離子濺射噴鍍金，樣品置于掃描電鏡下觀察微觀結構(電壓為10 kV，放大倍數為20 000倍)，并拍攝照片。見圖1。

圖1 CFZ-NCs掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron micrograph of CFZ-NCs

由圖1可知，CFZ-NCs呈不規則顆粒狀，表面致密，粒徑大部分在100～400 nm之間分布。

2.2.3體外溶出行為研究 評價CFZ混懸劑(以2 g·L-1羧甲基纖維素鈉溶液作為分散介質)和CFZ-NCs凍干粉的體外藥物溶出行為，選擇槳法，轉速為50 r·min-1，介質為pH值為1.2的鹽酸溶液(含SDS 質量濃度為5 mg·mL-1)，體積為900 mL，溫度為(37±0.5) ℃。分別取CFZ混懸劑和CFZ-NCs凍干粉(藥物含量均為50 mg)加入到溶出杯中，分別在10、20、30、45、60、90、120 min取出溶出介質5 mL(補加同溫同體積空白介質)，用0.22 μm濾膜過濾，稀釋后檢測藥物含量，計算藥物溶出度，繪制溶出度-時間曲線。結果見圖2。

圖2 CFZ混懸劑和CFZ-NCs凍干粉體外溶出度-時間曲線Fig.2 The in vitro dissolution-time curves of CFZ suspensions and CFZ-NCs lyophilized powder (n=6,

由圖2可知，CFZ混懸劑中藥物溶出速率緩慢，在120 min藥物溶出度僅達到20%左右，而將CFZ制備成納米晶體后，藥物溶出速度顯著提高，在45 min內藥物溶出度基本可達到95%，說明CFZ制備成納米晶體可顯著提高藥物的溶出度。

2.3穩定性考察 將CFZ-NCs凍干粉密封在西林瓶中，置于加速穩定性實驗箱(40 ℃,相對濕度為75%)中考察穩定性，分別在1、2、3、6個月取樣測定CFZ-NCs的理化性質以及在45 min的藥物溶出度，結果見表2。結果顯示，CFZ-NCs凍干粉在40 ℃條件下放置6個月，其粒徑分布、PDI和Zeta電位值基本未發生變化，45 min的藥物溶出度也均達到90%以上，說明CFZ-NCs制備成凍干粉后理化性質穩定，可長期保存。

表2 穩定性實驗結果Tab.2 The results of stability

2.4體內藥動學研究

2.4.1色譜條件 色譜柱：Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相：乙腈-0.02 mmol·L-1正磷酸溶液(55∶45);檢測波長：210 nm;柱溫：30 ℃;流速:1.0 mL·min-1;進樣量：20 μL。

2.4.2血漿處理 采用毛細管通過大鼠眼眶后神經叢取血0.5 mL，置于圓底離心管(內壁涂有肝素)中，以4 000 r·min-1離心10 min，取上層血漿100 μL，置于尖底離心管中，再加入乙腈300 μL，渦旋混合5 min，沉淀蛋白，以4 000 r·min-1離心10 min，取上清液300 μL，置于尖底離心管中，氮氣流下揮干有機溶劑，加入流動相100 μL溶解殘留物，以10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，按照2.4.1項下色譜條件檢測藥物含量，計算藥物質量濃度。

2.4.3動物實驗 取Wistar大鼠12只，體質量為(220±20) g，雌雄各半，實驗前禁食12 h，自由飲水。將大鼠按照隨機數字表法分為A、B 2組，A組大鼠口服給予CFZ混懸劑(以2 mg·mL-1羧甲基纖維素鈉溶液作為分散介質)，B組大鼠灌胃給予CFZ-NCs凍干粉，給藥劑量均為20 mg·kg-1，在預定的時間點(0、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h)采用毛細管通過大鼠眼眶后神經叢取血0.5 mL，置于圓底離心管(內壁涂有肝素)中，離心，分離血漿，按照2.4.2項下方法處理血漿樣品并進樣分析，數據輸入DAS軟件中計算藥物代謝動力學參數，結果見表3，并繪制血藥質量濃度-時間曲線，見圖3。

表3 大鼠藥物代謝動力學參數Tab.3 The pharmacokinetic parameters of rats

圖3 平均血藥質量濃度-時間曲線Fig.3 The mean plasma concentration-time curves of CFZ suspensions and CFZ-NCs lyophilized powder

藥物代謝動力學結果顯示，大鼠口服CFZ-NCs凍干粉后與口服CFZ混懸劑相比，其Cmax和AUC(0-∞)均顯著增加，相對生物利用度提高了312.4%。說明CFZ-NCs凍干粉能有效提高CFZ的口服生物利用度。

2.5藥效學評價 取Wistar大鼠，體質量為(220±20) g，雌雄各半，禁食不禁水24 h，大鼠腹膜內注射四氧嘧啶溶液(給藥劑量為150 mg·kg-1)，誘發糖尿病，定時定量給予稻米，1周后，選擇空腹血糖大于16.7 mmol·L-1的大鼠納入糖尿病模型[16]。將糖尿病模型大鼠隨機分成3組，每組6只，第1組大鼠作為空白對照組，給予飲用水，第2組大鼠給予CFZ混懸劑(以2 mg·mL-1羧甲基纖維素鈉溶液作為分散介質)，第3組大鼠給予CFZ-NCs凍干粉，給藥劑量均為20 mg·kg-1，并通過眼眶后神經叢定時取血0.1 mL，葡萄糖檢測試劑盒測定血糖，比較CFZ混懸劑和CFZ-NCs凍干粉的降血糖效果。結果見圖4。

圖4 CFZ混懸劑和CFZ-NCs凍干粉的大鼠體內血糖水平比較Fig.4 Comparison of blood glucose levels between CFZ suspensions and CFZ-NCs lyophilized powder in rats

由圖4可知，糖尿病模型大鼠分別口服CFZ混懸液和CFZ-NCs凍干粉后，其血糖水平均出現降低趨勢，口服CFZ-NCs凍干粉的大鼠在各時間點的血糖水平明顯低于口服CFZ混懸劑的大鼠，進一步說明CFZ-NCs凍干粉促進了藥物溶解和吸收，可持續并顯著降低血糖水平。

3 討論

由于納米晶體的粒徑非常小，比表面積巨大，將藥物制備成納米晶體后相應的表面自由能顯著增大，納米晶體在放置期間易聚集或粒徑增大，在處方中加入合適的穩定劑可降低表面張力，避免藥物晶體在制備過程和放置過程中聚集[17]。可以采用羥丙甲纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)等高分子聚合物和/或聚山梨酯(Tween 80)、TPGS、SDS等非離子型和離子型表面活性劑作為穩定劑[18-19]。聚合物和非離子表面活性劑吸附在納米晶體表面，其親水鏈向外延伸，阻礙藥物晶體之間聚集，通過空間位阻作用達到穩定目的，而離子型表面活性劑吸附在藥物晶體表面形成雙電層，藥物晶體相互靠近，距離減小到某個閾值時，具有相同電荷藥物晶體由于靜電作用相互排斥，阻礙藥物晶體之間聚集。

TPGS作為一種安全無毒、生物相容性好的藥物輔料，能抑制細胞膜內的P-gp活性，降低其對底物的外排作用，提高藥物滲透率，進而提高藥物的口服生物利用度[20-21]，作為一種安全的藥用輔料已被美國食品藥品監督管理局(FDA)批準用于藥品中。本研究將CFZ制備成納米晶體后顯著提高了藥物口服生物利用度，一方面是由于藥物的溶出速度增加，另一方面是由于處方中加入了TPGS，抑制了P-gp活性，降低了P-gp對CFZ的外排作用。