miR-579在腎癌中表達的臨床意義及其對腎癌細胞增殖的影響

程支利，陳智彬，郭鵬，李小榮

腎細胞癌約占成人惡性腫瘤的3%，占腎惡性腫瘤的90%，是繼前列腺癌和膀胱癌后第三常見的泌尿系統腫瘤，但病死率最高，約為25%， 我國僅2015年就死亡23 400例[1]。目前，腎細胞癌的最佳治療方法是手術切除，但20%～40%的患者在腎切除后會復發或轉移[2]。用于治療的靶點及隨訪的生物標志物非常少是導致其預后不良的主要原因之一[3]。因此，有必要尋找新的靶點或生物標志物用于腎切除術后的治療及預后評估。微小RNA(miRNA)是一種長約22個核苷酸的單鏈RNA，可與目標mRNA的3’端非翻譯區結合，從而調節基因表達[4-8]。研究表明，miRNA在多種腫瘤細胞中表達失調，參與腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移和凋亡，被認為是癌癥治療的潛在靶點[9-13]。微小RNA-579(miR-579)是近年發現的一種抑癌分子，僅在少數腫瘤類型中有所報道，Fattore等[14]發現miR-579可以抑制黑色素瘤細胞增殖、遷移、侵襲，促進細胞凋亡，誘導細胞周期阻滯于G0/G1期，研究顯示miR-579與鼠雙微體2(MDM2)mRNA的3'-端非編碼區特異性結合，導致其表達下調。此外，Kalhori等[15]發現miR-579通過與3’-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3’-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1)mRNA相互作用，從而抑制膠質母細胞瘤細胞的增殖。但是，miR-579對腎細胞癌發生發展的影響及PDK1、MDM2是否參與其作用機制均不清楚，因此本文旨在探討miR-579在腎細胞癌中表達的臨床意義及其生物學功能，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年1月—2014年3月四川省內江市第一人民醫院泌尿外科手術治療腎癌患者92例，患者術前均未進行放化療，術中獲取癌組織進行病理學檢查確診，取癌組織及癌旁正常組織(距腫瘤邊緣4～8 cm的正常腎組織)樣本，保存于液氮中作為研究對象，其中男54例，女38例，年齡41～75(59.32±9.96)歲。根據癌組織中miRNA-579水平的中位數，將患者分為低表達組和高表達組(各46例)。低表達組男24例，女22例，年齡32～59(51.43±9.61)歲23例，60～76(65.20±6.74)歲23例；腫瘤直徑1.1～4.8(3.9±1.1)cm 18例，5.1～9.8(6.8±1.5)cm 28例；高分化1例，中分化30例，低分化15例；Ⅰ期2例，Ⅱ期8例，Ⅲ期26例，Ⅳ期10例；透明細胞癌36例，非透明細胞癌10例。高表達組男30例，女16例，年齡35～59(52.26±9.38)歲18例，60～78(65.88±7.02)歲28例；腫瘤直徑1.2～4.5(3.7±0.9)cm 31例，5.0～9.1(6.4±1.1)cm 15例；高分化9例，中分化31例，低分化6例；Ⅰ期6例，Ⅱ期15例，Ⅲ期23例，Ⅳ期2例；透明細胞癌31例，非透明細胞癌15例。2組患者腫瘤直徑、分化程度、臨床分期比較差異有統計學意義(P<0.05)，而性別、年齡、病理類型比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 細胞學實驗 為了研究miR-579對腎癌細胞增殖的影響，本研究首先檢測了miR-579在不同細胞株間的表達水平，包括人正常腎臟細胞株HK-2與腎癌細胞株Caki-1、A498、769-P、786-O(均購自美國模式培養物保藏中心，ATCC)，結果顯示miR-579在A498細胞種的表達水平最低，因此選擇A498細胞作為轉染對象，以觀察上調miR-579水平能否抑制A498細胞的增殖。細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液(美國Gibco公司)中，放置于37℃、5% CO2的培養箱。miR-579類似物陰性對照(miR-NC)與miR-579類似物(miR-579 mimics)由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，將A498細胞按隨機數字表法分為3組，即對照組、miR-NC組、miR-579組，每組設3個復孔，每孔2×105個細胞。miR-NC組和miR-579組分別使用miR-NC和miR-579 mimics進行轉染，按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書(美國Invitrogen公司)進行操作。對照組不進行轉染。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 腎癌組織 miR-579表達水平檢測：采用熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測不同組織(患者癌組織與癌旁正常組織)及不同細胞(HK-2、Caki-1、A498、769-P、786-O及對照組、miR-NC組、miR-579組)中的miR-579水平。Trizol法(美國Promega公司)常規提取組織及細胞中的總RNA，然后應用逆轉錄試劑盒(日本Takara公司)將其逆轉錄為cDNA，最后應用PCR試劑盒(日本Takara公司)對目的基因進行擴增，反應條件：95℃3 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，共進行40個循環。以U6作為內參基因，記錄各基因PCR擴增后的CT值，使用2-△△CT法計算組織及細胞中miR-579的表達水平。引物合成于上海生工生物工程股份有限公司，見表1。

表1 引物序列

1.3.2 腎癌細胞吸光度值(OD值)測定： MTT法檢測3組細胞增殖水平。將3組細胞以5×103的細胞密度接種于96孔板，繼續培養24 h、48 h和72 h，將培養基吸棄，加入無血清培養液180 μl和MTT溶液(5 mg/ml，美國Sigma公司)20 μl，在培養箱中繼續孵育4 h，加入DMSO(美國Amersco公司)150 μl，震蕩5 min后，使用酶標儀(美國Multiskan公司)于450 nm波長下測定OD值。

1.3.3 腎癌細胞PDK1、MDM2蛋白測定： 使用RIPA裂解液(上海碧云天公司)提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天公司)測定蛋白濃度。取40 g的總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉印后常規封閉2 h，加入一抗4℃過夜孵育，各一抗稀釋濃度：PDK1 1∶1 000，MDM2 1∶1 000，GAPDH 1∶3 000均購自英國Abcam公司。次日，洗膜3次，加入二抗(武漢博士德公司)室溫孵育1 h，洗膜3次，ECL液(上海碧云天公司)顯色，凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)下拍照。使用Quantity One軟件測定各條帶的灰度值，將對照組中目的蛋白與GAPDH灰度值之比作為1。

2 結 果

2.1 腎癌與癌旁組織中miR-579表達水平比較 腎癌組織中miR-579表達水平低于癌旁組織，差異有統計學意義(0.63±0.26 vs. 1.44±0.42,t=16.010，P=0.000)

2.2 不同類型腎癌細胞株miR-579表達水平比較 與人正常腎臟細胞株HK-2(1.00±0.14)比較，腎癌細胞株Caki-1(0.39±0.15)、A498(0.18±0.08)、769-P(0.28±0.10)、786-O(0.25±0.11)miR-579的表達水平均降低(F/P=78.510/0.000)，且A498、769-P、786-O中miR-579表達水平顯著低于Caki-1，差異均有統計學意義(F/P=5.987/0.002)，而A498、769-P、786-O間比較，差異無統計學意義(F/P=2.772/0.080)，見圖1。

注： 與HK-2細胞比較，aP<0.05；與Caki-1細胞比較，bP<0.05

2.3 3組細胞中miR-579表達水平比較 miR-579組miR-579表達水平為3.11±0.24，顯著高于對照組(1.00±0.12)和miR-NC組(0.96±0.15)，差異均有統計學意義(F/P=480.200/0.000)，而對照組和miR-NC組比較，差異無統計學意義(t/P=0.659/0.519)，見圖2。

注：與對照組比較，aP<0.05； 與miR-NC組比較，bP<0.05

2.4 不同臨床/病理特征癌組織中miR-579水平比較 腎癌組織中miRNA-579水平在不同性別、年齡、病理類型中比較，差異無統計學意義(P>0.05)， 腫瘤直徑≥5 cm、分化程度低、臨床分期高的癌組織中miRNA-579水平顯著低于腫瘤直徑<5 cm、分化程度高、臨床分期低者，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同臨床/病理特征癌組織中miR-579

2.5 miR-579對腎癌細胞增殖的影響 與對照組和miR-NC組比較，miR-579組細胞在培養48 h、72 h時的OD值降低，差異有統計學意義(P<0.05)，而對照組和miR-NC組3個時間點的OD值相比較，差異無統計學意義(t/P=0.362/0.721、0.384/0.706、0.503/0.621)，見表3。

表3 3組細胞增殖水平(OD值)比較

2.6 miR-579對腎癌細胞中PDK1和MDM2表達的影響 與對照組和miR-NC組比較，miR-579組細胞中PDK1和MDM2的表達水平降低(P均<0.05)，而對照組和miR-NC組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3，表4。

圖3 各組細胞PDK1和MDM2的表達水平比較

表4 3組細胞PDK1和MDM2表達水平比較

2.7 miR-579水平與腎癌預后的關系 對不同miR-579水平的腎癌患者進行生存分析，結果顯示低表達組患者的生存率顯著低于高表達組，差異有統計學意義(χ2=4.684，P=0.030)，見圖4。

圖4 2組患者生存率比較

3 討 論

盡管miR-579在多種腫瘤類型中被發現表達失調，但是一直未得到單獨且深入的研究，Li等[16]通過深度測序及相關調控網絡分析發現，包括miR-579在內的14個miRNA可用于預測神經膠質瘤患者的生存率；Lin等[17]研究了肝轉移性結直腸癌與非轉移性結直腸癌中miRNA表達的差異性，結果表明28個miRNA在肝轉移癌中的表達發生變化，其中miR-579表達下調。本研究則基于上述報道，對miR-579在腎癌中的表達情況進行了檢測，并深入探討了其臨床意義與生物學功能，認為其在臨床和基礎中均具有較好的研究價值和應用前景。

本研究首先對腎癌組織及癌旁組織中miR-579的表達水平進行qRT-PCR檢測，結果顯示癌組織中miR-579表達水平顯著低于癌旁組織，與Lin等[17]報道相一致，提示miR-579可能是一種抑癌基因。此外，腫瘤直徑大、分化程度低、臨床分期高的患者癌組織中miRNA-579水平較低，表明miR-579與腎癌的發生發展密切相關。為了進一步探討miR-579水平對腎癌預后的影響，本研究對所有患者的生存情況進行了為期60個月的隨訪，結果顯示低表達組患者的生存率明顯低于高表達組，提示低水平的miR-579可用于預測患者預后不良。但Azizian等[18]發現，miR-579在直腸癌組織中表達升高，且與患者的低生存率顯著相關，與本研究結論不一致，可能與腫瘤類型、病例數量、隨訪時間等因素有關，未來需要通過增加病例、嚴格隨訪等方法進一步證實本研究結論。

本研究通過體外細胞試驗對miR-579的生物學功能做了進一步研究，首先使用qRT-PCR檢測了不同類型腎癌細胞中miR-579的表達水平，結果顯示腎癌細胞株Caki-1、A498、769-P、786-O中miR-579的表達水平均顯著低于人正常腎臟細胞株HK-2，與腎癌組織中低表達的趨勢相吻合。其中，A498細胞中miR-579表達水平降低最為明顯，因此本研究選擇A498細胞作為后續研究的細胞類型。體外轉染miR-579模擬物后可顯著抑制A498細胞增殖，進一步表明了miR-579的抑癌效應。

為了探討miR-579抑制腎癌細胞增殖的分子機制，在miR-579的相關報道中，發現2個可能的靶向抑制分子，即PDK1和MDM2[14- 15]。PDK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可以促進AKT蛋白質磷酸化，從而激活PI3K/AKT信號通路，在細胞增殖、代謝等生理病理過程中發揮重要作用[19-22]。Wang等[23]發現，miR-375可通過靶向抑制PDK1，降低腎癌細胞的增殖和遷移，本結果也顯示，miR-579組細胞中PDK1表達水平低于對照組和miR-NC組，表明PDK1可能是miR-579的靶點之一。MDM2是p53的負性調節因子，參與調節DNA損傷修復、細胞周期等過程，與腫瘤的發生發展密切相關[24-26]。本結果顯示，體外轉染miR-579模擬物可抑制MDM2表達，與Fattore等[14]的研究結論相一致，即miR-579可與MDM2相互作用而發揮靶向抑制效應。

本研究的不足：(1)研究僅檢測了miR-579在組織中的表達情況，其在血清中的表達尚不清楚，血清miR-579水平能否用于早期診斷也有待進一步研究；(2)除細胞增殖外，腎癌細胞的生物學行為還包括凋亡、遷移、侵襲等，但是本研究未對這些指標進行全面系統的檢測；(3)除PDK1和MDM2外，其他基因的表達也有可能是miR-579的靶點，未來仍然需要通過生物信息學、雙螢光素酶報告基因試驗等方法進行篩選和驗證。

綜上所述，miR-579在腎癌組織和細胞中低表達，與腫瘤直徑、分化程度、臨床分期及低生存率有關。體外轉染miR-579模擬物可抑制細胞增殖，可能與抑制PDK1和MDM2表達有關。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

程支利：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；陳智彬：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；郭鵬、李小榮：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改