miR-132在上皮性卵巢癌中的表達及作用機制研究

楊波，李勝澤，郭蘇陽，馬珊珊，張慶松，李玉芝

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是女性癌癥中最常見的一種，是導致女性癌癥死亡的第五大常見原因[1]。全世界每年有約23萬名婦女被確診，其中15萬人最終病死，診斷5年后存活率約46%[2]，嚴重威脅女性生命安全。篩查和診斷困難、化療耐藥性及較高復發和轉移性是EOC高病死率的主要因素[3]。因此，尋找卵巢癌新型治療手段或治療靶標，降低患者病死率成為目前研究的熱點。沙敏等[4]研究發現，微小RNA-132(miR-132)可靶向調節高爾基體糖蛋白73抑制肝癌的發生、發展和轉移。miR-132可靶向性別決定區Y-box 4 蛋白抑制肺癌細胞在體外的遷移和侵襲[5]。推測miR-132可能與腫瘤細胞遷移、侵襲過程有關[6]。以往研究發現，miR-132在卵巢癌組織和細胞中低表達，且過表達miR-132可抑制卵巢癌細胞增殖，促進其凋亡[7]，但其與卵巢癌復發轉移的關系尚不清楚。因此本研究通過檢測miR-132在人卵巢癌組織和細胞中表達水平，并以miR-132相對表達水平較低的卵巢癌SKOV3細胞為研究對象，觀察過表達miR-132對卵巢癌SKOV3細胞侵襲、遷移的影響，并進一步探討可能的作用機制，以期為尋找有效生物靶標治療卵巢癌提供一定理論依據，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)組織標本和細胞系: 收集2018年10月—2020年2月蚌埠醫學院第一附屬醫院婦瘤科手術切除的卵巢癌及癌旁非腫瘤組織標本36份，均經病理診斷確診，置于-80℃保存。術前均未進行放療或化療。人正常卵巢上皮細胞(IOSE80，購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司)、卵巢癌SKOV3細胞(購自上海瑞鹿生物技術有限公司)。(2)試藥及試劑：實時熒光定量PCR(qRT-PCR)引物及miR-132慢病毒構建及包裝均由上海吉瑪生物公司設計合成；qRT-PCR試劑盒購自美國ThermoFisher公司；反轉錄試劑盒購自美國Fermentas公司；Trizol試劑購自美國Sigma公司；熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國Promega公司；熒光素酶報告載體由上漢恒生物公司提供；小鼠抗人單克隆絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；兔抗人基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)多克隆抗體、兔抗人MMP-9多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體均購自美國abcam公司；辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋公司。(3)儀器設備：電泳儀購自美國Bio-Rad公司，qRT-PCR儀購自美國ABI公司，酶標儀購自奧地利CliniBio公司，凝膠成像儀購自南京創睿儀器儀表有限公司。

1.2.1 實時熒光定量PCR檢測卵巢癌組織中miR-132相對表達水平：從卵巢癌病理組織切下約100 mg置于研缽中加入液氮研磨至細粉，移至裝有1 ml的Trizol離心管中，提取總RNA，根據引物合成軟件Premier 6.0設計引物序列，見表1，用反轉錄試劑盒對RNA合成cDNA。按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書配20 μl反應體系，反應條件：95℃預變性15 min、95℃變性10 s、56℃退火20 s、72℃延伸50 s，40個循環，以U6為對照，采用2-△△Ct法分析miR-132相對表達水平。

表1 miR-132、U6的qRT-PCR引物序列

1.2.2 細胞轉染及細胞分組：選取miR-132相對表達水平最低的卵巢癌SKOV3細胞和正常卵巢上皮細胞(IOSE80)于37℃，5% CO2培養箱中培養，取對數生長期細胞密度為1×106/ml，每孔200 μl接種于24孔板，正常卵巢上皮細胞(IOSE80)為正常對照組，卵巢癌SKOV3細胞分為空白對照組、LV-NC(陰性對照)組和LV-miR-132 mimic(模擬物)組，每組8個復孔，取2支EP管分別加入200 μl完全培養基備用，管中分別加入24 μl濃度為1×108TU/ml慢病毒和慢病毒空載體(轉染復數MOI值為60)，均勻混合后各加入4 μl濃度為6 μg/ml 聚凝胺備用；將EP管中的慢病毒空載體和慢病毒液加入LV-NC組和LV-miR-132 mimic，空白對照組加入PBS 28 μl，置培養箱培養12 h后，更換新鮮完全培養基繼續培養。

1.2.3 qRT-PCR檢測各組細胞中miR-132、MAPK1 mRNA相對表達水平：應用Trizol從上述各組細胞中提取總RNA，以qRT-PCR方法檢測各組細胞中miR-132、MAPK1相對表達水平，MAPK1以GAPDH為對照，其中MAPK1和GAPDH引物序列見表2。

表2 MAPK1、GAPDH的qRT-PCR引物序列

1.2.4 Transwell法檢測卵巢癌SKOV3細胞的侵襲率：上述轉染細胞48 h后，常規消化離心，調整細胞密度為2.5×105/ml，取200 μl加入Transwell小室的上室中，24孔板下室加入完全培養基 500 μl，培養12 h后，棄培養基，擦拭Matrigel和上室殘留細胞，置于新的24孔板中，4%多聚甲醛室溫固定30 min，棄固定液，0.2%結晶紫染色10 min，PBS清洗，風干后在倒置顯微鏡下隨機選取5個視野觀察并記錄穿膜細胞數(著色為紫色)。侵襲率=實驗組穿膜細胞平均數/對照組穿膜細胞平均數×100%。

1.2.5 細胞劃痕實驗檢測卵巢癌SKOV3細胞的遷移率：上述轉染細胞48 h后，行各組細胞消化、離心后調整密度為2.5×105個/ml，每孔2 ml接種于六孔板中，第2天用無菌500 μl槍頭垂直孔板背后的橫線，制造細胞劃痕，確保每個孔內劃痕寬度一致，PBS清洗3次，洗去劃下的細胞，12、24、48 h取樣拍照，對各組細胞分析，細胞遷移率=(0 h劃痕區域寬度-拍照時間劃痕區域寬度)/0 h劃痕區域寬度×100%。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測卵巢癌SKOV3細胞與MAPK1的靶向關系：分別構建含有MAPK1的野生型和突變型3′-UTR序列的熒光素酶報告基因質粒(MAPK1-Wt和MAPK1-Mut)。收集卵巢癌SKOV3細胞，調整細胞密度為2×105/孔，接種于24孔板中，miR-132 mimic或NC分別與MAPK1-Wt質粒和MAPK1-Mut質粒共同轉染至卵巢癌SKOV3細胞，每組8個復孔，繼續培養48 h。按照熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明對熒光素酶活性進行測定。

1.2.7 Western-blot檢測卵巢癌SKOV3細胞中MAPK1、遷移與侵襲相關蛋白表達： 上述細胞轉染72 h，分別收集各組細胞，PBS清洗，加入含PMSF的RIPA裂解液在冰水浴中處理，提取蛋白，BCA法測定各組蛋白的濃度，加入蛋白上樣緩沖液(體積為蛋白樣品液的4倍)，沸水浴加熱3～5 min，放于-20℃保存。按照SDS-PAGE凝膠配方表制備10%分離膠和5%濃縮膠，以每泳道30 μg蛋白上樣，蛋白凝膠電泳，根據蛋白marker切膠，轉膜，對抗體MAPK1、MMP-9、MMP-2、GAPDH均按照1∶500的比例稀釋后4℃孵育過夜，放搖床1.5 h，TBST清洗，加入辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG二抗，室溫孵育并放搖床2 h，TBST清洗后，參考ECL發光液說明書對條帶孵育、曝光、顯影。Image J對條帶灰度值分析。

ATB混合料碾壓應遵循“緊跟慢壓、高頻低幅”原則，壓路機應緊跟攤鋪機后進行碾壓，避免混合料熱量散失過多，初壓使用13T雙鋼輪振動壓路機靜壓2遍；復壓采用13T振動壓路機振動碾壓3～4遍，碾壓溫度控制為100～110℃；終壓使用11T鋼輪壓路機靜壓2～3遍以消除輪印，碾壓溫度不低于80℃。

2 結 果

2.1 卵巢癌組織與癌旁組織中miR-132相對表達水平比較 癌旁組織miR-132相對表達水平為(1.02±0.12)，高于卵巢癌組織的(0.50±0.11)，差異有統計學意義(t/P=19.166/0.000)。

2.2 各組細胞miR-132、MAPK1 mRNA相對表達水平比較 與正常對照組比較，空白對照組miR-132相對表達水平顯著降低，MAPK1 mRNA相對表達水平顯著升高(P<0.05)；與空白對照組、LV-NC組比較，LV-miR-132 mimic組miR-132相對表達水平顯著升高，MAPK1 mRNA相對表達水平顯著降低(P<0.05)；而空白對照組與LV-NC組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組細胞中miR-132、MAPK1 mRNA相對表達水平比較

2.3 各組SKOV3細胞侵襲能力比較 與空白對照組細胞侵襲率(81.00±8.20)%、LV-NC組(73.56±7.77)%比較，LV-miR-132 mimic組(38.86±6.86)%顯著降低，差異有統計學意義(F/P=19.166/0.000)，而空白對照組、LV-NC組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 各組SKOV3細胞侵襲能力比較 (結晶紫染色，×200)

2.4 各組SKOV3細胞遷移能力比較 與空白對照組、LV-NC組比較，LV-miR-132 mimic組細胞遷移率顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，而空白對照組、LV-NC組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2、表4。

圖2 各組卵巢癌SKOV3細胞遷移率比較

表4 各組卵巢癌SKOV3細胞遷移率比較

2.5 各組SKOV3細胞MAPK1、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平比較 與空白對照組、LV-NC組比較，LV-miR-132 mimic組細胞MAPK1、MMP-2、MMP-9蛋白相對表達水平均顯著降低(P<0.05)，而空白對照組、LV-NC組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3、表5。

圖3 各組細胞中MAPK1、MMP-2、MMP-9蛋白免疫印跡圖

表5 各組細胞中MAPK1、MMP-2、MMP-9蛋白表達比較

2.6 miR-132與MAPK1的靶向關系 應用microrna.org數據庫預測MAPK1 3′-UTR與miR-132存在結合位點。而與miR-132 NC+MAPK1-Wt 3′-UTR組比較，miR-132 mimic+MAPK1-Wt 3′-UTR組熒光素酶相對活性顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；miR-132 NC+MAPK1-Mut 3′-UTR組、miR-132 mimic+MAPK1-Mut 3′-UTR組熒光素酶相對活性比較差異無統計學意義(P>0.05)；與miR-132 mimic+MAPK1-Wt 3′-UTR組比較，miR-132 mimic+MAPK1-Mut 3′-UTR組熒光素酶相對活性顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表6。

表6 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-132與MAPK1靶向關系

3 討 論

卵巢癌是女性中僅次于乳腺癌、腸癌、肺癌和子宮內膜癌的第五大常見癌癥，是婦科惡性腫瘤死亡的主要原因之一[8]。卵巢惡性腫瘤中上皮性卵巢癌約占85%。由于其表現隱蔽，往往直到晚期才被診斷，導致高病死率。在過去20年中，發病率和病死率一直相當穩定，盡管近年在外科手術治療方面已取得較大進展，但由于多數患者確診時已發展至晚期，導致較高的病死率[9]。因此尋找預測卵巢癌分子標志物并對其生物學功能進行深入研究，將有助于提高卵巢癌診斷和治療水平，具有重要的臨床意義。

微小RNAs(microRNA，miRNAs)是一種小的非編碼RNA分子[10]，它可調節多種基因的表達，目前，已知的人類miRNAs有1 000多個，控制著50%以上哺乳動物蛋白質編碼基因，miRNAs表達異常與不同疾病發生發展的關系，已成為近年研究熱點。miRNAs可通過靶向關鍵蛋白編碼基因，參與卵巢癌發生、發展和轉移，如miR-628-5p可通過靶向下調成纖維細胞生長因子受體2的表達，誘導卵巢癌細胞凋亡，顯著抑制腫瘤生長并降低其致瘤性[11]；miR-338-3p通過靶向Runx2顯著抑制卵巢癌細胞增殖、集落形成、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡[12]。miR-132存在于人類染色體17p13，與中樞神經系統、腫瘤、炎性反應、和血管生長密切相關[13]，但其對上皮性卵巢癌的增殖、凋亡、侵襲轉移能力的影響目前還未有明確闡述。本研究結果顯示，卵巢癌組織中miR-132相對表達水平較癌旁組織顯著降低，卵巢癌SKOV3細胞中miR-132相對表達水平較正常卵巢上皮細胞(IOSE80)顯著降低，表明miR-132在卵巢癌組織和癌細胞中表達下調，與以往研究一致[7]，表明其在卵巢癌的發生發展中可能起到重要的調控作用。本研究進一步采用慢病毒轉染構建miR-132過表達卵巢癌SKOV3細胞，結果顯示，與空白對照組、LV-NC組比較，LV-miR-132 mimic組細胞中miR-132相對表達水平顯著升高，提示miR-132過表達SKOV3細胞系建立成功。

由于卵巢癌細胞的侵襲性生長特征，使得腫瘤完全切除存在較大困難，腫瘤易出現復發和轉移，導致患者病死率較高[14-15]，因而抑制癌細胞侵襲轉移是卵巢癌的重要治療方向。本研究通過Transwell法及細胞劃痕實驗檢測miR-132對卵巢癌SKOV3細胞侵襲轉移能力的影響，結果顯示，SKOV3細胞經LV-miR-132 mimic慢病毒轉染后，其侵襲率、遷移率均顯著降低，表明miR-132可調控卵巢癌SKOV3細胞侵襲和遷移過程，上調其表達可顯著抑制卵巢癌侵襲、轉移。研究表明，腫瘤細胞在侵襲、轉移過程中，可離開原發灶，透過基底膜進入血管，繼而移出血管或淋巴管形成微小轉移灶，再進一步增殖進而形成轉移腫瘤。細胞外基質是腫瘤細胞轉移的第一道屏障，腫瘤細胞可通過產生蛋白水解酶降解細胞外基質，其中MMP-2、MMP-9可降解細胞外基質，并分解Ⅳ型膠原蛋白，增強腫瘤細胞的運動性和黏附能力，在腫瘤細胞侵襲和遷移過程中具有重要作用[16]。本研究結果顯示，與空白對照組、LV-NC組比較，LV-miR-132 mimic組細胞MMP-2、MMP-9蛋白相對表達水平均顯著降低，表明miR-132過表達可下調MMP-2、MMP-9蛋白表達，抑制卵巢癌SKOV3細胞侵襲和遷移。

MAPK1屬于MAPK激酶家族，可通過激活MAPK信號通路，促進MMP-13、含Ⅰ型血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶-4(ADAMTS-4)等細胞外基質分解代謝因子表達，抑制Ⅱ型膠原等合成代謝蛋白表達，導致細胞外基質受損，與腫瘤細胞轉移有關[17-19]。近年研究發現，MAPK1在不同類型的癌癥中表達異常，Flum等[20]研究發現，miR-217-5p可靶向MAPK1抑制大腸癌細胞遷移和侵襲，誘導細胞凋亡。研究表明miR-508通過靶向MAPK1抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲[21]。Li[22]等研究發現，miR-329-3p過表達可靶向抑制MAPK1從而抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。此外，He等[23]研究發現，miR-132-3P靶向抑制MAPK1抑制大腸癌發生發展。另有研究表明，miR-132過表達可調控ERK1/2對NP細胞外基質的降解作用[24]。本研究發現，卵巢癌SKOV3細胞中MAPK1 mRNA相對表達水平較正常卵巢上皮細胞顯著升高，以LV-miR-132 mimic慢病毒轉染SKOV3細胞后，其細胞中MAPK1 mRNA和蛋白相對表達水平均降低，表明MAPK1在卵巢癌SKOV3細胞中表達上調，miR-132可下調MAPK1表達，推測miR-132可能通過靶向下調MAPK1表達來抑制卵巢癌細胞遷移、侵襲。本研究基于TargetScan、microRNA.org、miRbase數據庫預測發現，miR-132與MAPK1存在結合位點，進一步采用雙熒光素酶報告實驗驗證發現，miR-132 mimic+MAPK1-Wt 3′-UTR組的熒光素酶相對活性低于miR-132 NC+MAPK1-Wt 3′-UTR組，而將MAPK1 3′突變后，其熒光素酶相對活性與miR-132 NC+MAPK1-Wt 3′-UTR組相比無明顯變化，表明miR-132能夠直接靶向下調MAPK1的表達，進而影響MMP-2、MMP-9蛋白表達，降低卵巢癌細胞遷移侵襲能力。

綜上所述，上調miR-132可能通過靶向MAPK1抑制卵巢癌細胞遷移、侵襲，為闡述卵巢癌發生發展機制、識別和鑒定腫瘤標志物、開展腫瘤靶向治療提供了新理論依據。本研究的不足之處在于沒有敲除或沉默miR-132以進一步驗證miR-132在卵巢癌細胞遷移、侵襲中的作用，將在以后的研究進一步完善驗證。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

楊波：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；李勝澤：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；郭蘇陽、馬珊珊：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；張慶松：進行統計學分析；李玉芝：課題設計，論文撰寫