超聲對谷氨酸棒桿菌發酵L-異亮氨酸的影響

熊海波，劉云鵬，徐慶陽,2,3*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津， 300457)2(天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津， 300457)3(代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室，天津， 300457)

L-異亮氨酸作為哺乳動物8種必需氨基酸之一，是合成人體激素及酶類的原料，能夠促進蛋白質合成并抑制其分解[1]。近年來,隨著L-異亮氨酸在醫藥保健、食品加工和飼料工業中的應用研究不斷深入,市場對L-異亮氨酸的需求在不斷生長。L-異亮氨酸雖已實現工業化生產,但目前產量仍不能滿足需要，目前我國L-異亮氨酸的需求缺口較大,并且年需求量逐年增加[2]。

一般認為微生物在生長旺盛期，正常代謝不會出現在培養液中大量分泌特定的中間代謝物的現象，谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamate)為了積累特定的氨基酸，必須使用某些方法使其代謝或結構異?；痆3-5]。谷氨酸棒桿菌發酵在不同的階段細胞形態會產生不同的變化，增殖培養時期菌株以生長分裂、倍速擴增菌體生物量為目的，而在生產目的產物異亮氨酸時，需要實現菌體形態的“發酵轉換”，限制細胞膜的合成，菌體伸長、膨脹，形成生產型細胞，開始積累L-異亮氨酸[6-7]。而這種“發酵轉換”，需要通過各種物理、化學或生物手段對細胞膜的合成或細胞膜本身進行干擾或破壞[8]。這些方法包括發酵液中添加表面活性劑、CaCl2、限制發酵培養基中生物素含量、減少葡萄糖供應使菌體處于亞生長狀態等[9]。

研究表明超聲對發酵液產生的微擾動可以加速細胞間的物質交換，加強發酵液中的CO2和O2的交換速率，從而促進細胞的增殖，而超聲產生的切向力可在細胞表面瞬間造成微傷，使細胞壁局部破裂，增強細胞膜的通透性和產酸能力[14]。研究通過在發酵罐內添加超聲裝置，在發酵的某些時期對發酵液進行在線超聲，通過增強發酵液的流動性及增強細胞膜的通透性，解決谷氨酸棒桿菌發酵適應期較長，菌體產酸轉型慢、轉型不徹底的問題[10-13]。

1 材料與方法

1.1 菌種

谷氨酸棒桿菌YILM1504，由天津科技大學代謝工程實驗室保存。

1.2 發酵培養基

葡萄糖60 g/L，酵母粉3 g/L，蛋白胨12 g/L，(NH4)2SO4·7H2O 3 g/L，KH2PO41.6 g/L，VB10.3 mg/L，豆餅水解液15 mL/L，賴氨酸1 g/L，谷氨酸3 g/L，甲硫氨酸0.2 g/L，玉米漿干粉30 g/L。

1.3 儀器與設備

LDZH-100KBS型全自動立式蒸汽滅菌器，天津博鑫生物科技有限公司；5 L 自動控制發酵罐，上海保興生物設備工程有限公司；SBA-40E 生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所；Agilent1200高效液相色譜儀，Agilent Technologies；KQ-C 高壓蒸汽發生器，上海奉賢協新機電廠；752 分光光度計，上海分析儀器廠；OLYMPUS 生物顯微鏡，日本 OLYMPUS 會社。

1.4 培養方法

種子罐培養條件：接種量2支茄形瓶(250 mL)，發酵體積2 L，培養溫度32 ℃，pH 6.8～7.0，溶氧30%以上，轉速與溶氧聯動，種子培養12～15 h。

發酵罐培養條件：接種量600 mL，發酵體積3 L, 培養溫度32 ℃，pH 6.8～7.0，溶氧30%以上，轉速與溶氧聯動，發酵時間36～40 h。

1.5 實驗方法

通過單因素試驗對超聲條件的確定，如表1所示，選取超聲周期、超聲功率、超聲頻率、超聲時間、超聲模式進行5因素4水平的L16(54)正交試驗，對試驗結果進行分析。采用綜合平衡分析法確定超聲的最佳組合條件[15]。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Horizontal table of orthogonal experimental factors

1.6 檢測方法

1.6.1 細胞膜內外兩側Ca2+濃度

Ca2+濃度檢測參考文獻[16]進行。

1.6.2L-蘇氨酸脫氨基酶活性檢測

在發酵罐中取適量的菌液，4 ℃ 8 000 r/min離心收集菌體，用50 mmol/L Tris-HCl清洗菌體2次，并重懸菌體。然后將懸浮菌體，經過超聲破碎(開2 s停3 s、4 ℃、400 W、10 min)，4 ℃ 12 000 r/min 離心30 min去除細胞碎片，上清液即為粗酶液。蛋白濃度通過BCA Protein Assay Kit測定。酶活性重復3次測定。L-蘇氨酸脫氨基酶的酶活性通過檢測ɑ-酮丁酸的生成來確定。L-蘇氨酸脫氨基酶的酶活定義為每分鐘生成1 μmol ɑ-酮丁酸所需要的酶活為1 U[17]。

2 結果與分析

2.1 超聲對菌體生物量的影響

2.1.1 超聲對菌體不同生長階段的影響

L-異亮氨酸發酵是一個連續動態過程，在不同的生長階段菌體形態結構、代謝途徑不同，超聲所起的作用不同。實驗將菌體發酵分為適應期、對數生長期、平穩期、衰亡期4個階段，實驗設計在不同階段超聲，探究不同階段超聲對菌體的影響。

如圖1所示，對谷氨酸棒桿菌發酵不同生長階段1 h連續超聲，在適應期、對數期和平穩期生物量分別增加了15.6%、63.2%、23.6%，這可能是在適應期及對數生長期，超聲對菌體損傷較小，超聲加劇了培養基的擾動，加速了罐內營養物質及氧氣的微擾動，提高了細胞膜內外物質交換的傳輸速率；而在平穩期，超聲所起到的微擾動能力，解決了副產物堆積、營養供應不足等問題，增加了菌體活力[18]。但同時，超聲對衰亡期菌體生長產生負面效果，菌體生物量下降了35.8%，這是因為在菌體衰亡期，超聲剪切作用力加速了菌體破碎死亡。因此可在適應期、對數生長期和平穩期超聲發酵，提高菌體總體基數，為產酸總量的提高提供生物量基礎。

圖1 超聲對菌體不同生長階段的影響Fig.1 Influence of ultrasound on different growth stages of bacteria

2.1.2 超聲功率對菌體生物量的影響

實驗設計在對數生長期，分別用60、80、100、120 W/L不同的超聲功率，探究超聲功率對菌體生物量的影響。

如圖2所示，超聲功率<100 W/L時，對菌體的增長均有效果，在功率達到80 W/L時效果最好；但功率超過120 W/L時，對菌體生長產生抑制作用。超聲刺激菌體生長不一定與功率成正比，有時小功率也會產生增殖效果，但功率過小就會失去微擾動及菌體刺激作用；而功率大到一定的數值，雖然擾動及剪切效果增強，但空化強度大大增加，干擾菌體正常的生長分裂，使菌體細胞膜內外環境失衡，正常的菌體形態發生形變，破碎死亡，降低菌體活力[19]。

圖2 超聲功率對菌體生物量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the biomass of bacteria

2.1.3 超聲頻率對菌體生物量的影響

實驗設計在對數生長期，分別用10、18、26、34、42 kHz超聲頻率，探究超聲頻率對谷氨酸棒桿菌生物量的影響。

由圖3可知，不同的超聲頻率對菌體生物量的影響較大，在超聲頻率為18 kHz時，菌體生物量下降了13.6%，但當超聲頻率為26 kHz時，菌體生物量增加了42.4%，隨后將超聲頻率增加到42 kHz時，菌體生物量劇烈下降了45.3%。菌體的增長量隨超聲頻率的梯度增加呈現極陡的波浪狀，生物量急速升降。這種現象可能類似于電磁波的窗效應，指在某一頻段內，只有某些個離散的、頻率區間極窄的電磁波才能產生的生物學效應，而不同于圖2所示80 W/L是該菌功率窗，該菌的生物學效應在26 kHz還存在1個頻率窗[20]。

圖3 超聲頻率對菌體生物量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic frequency on the biomass of bacteria

2.1.4 超聲時間對菌體生物量的影響

在對數生長期分別超聲0、2、4、6、8、10 h后，檢測發酵結束后菌體生物量，探究超聲時間對菌體生物量的影響。

從圖4可知，0～8 h隨著超聲時間的增加，菌體生物量逐漸增加，在超聲6 h后，菌體增加量達到最大，隨后對菌體生長產生抑制作用，在超聲10 h后菌體量比對照組降低了21.2%。對數生長期菌體增殖速度快，低頻率低能量的超聲對菌體的損傷較小，同時短時間的空化作用，形成的流體微擾動，可以增加細胞內外物質的交換速率，有利于菌體的生長；但超聲時間過長使得空化事件增多，對細胞膜通透性影響增大，損壞了細胞的結構，從而引起細胞崩解[21]。

圖4 超聲時間對菌體生物量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the biomass of bacteria

2.1.5 超聲模式對菌體生物量的影響

設計在對數生長期使用不同的處理模式，分別為先開10 s，再停10、20、30、40、50 s，循環往復，持續6 h，探究間隔時間對菌體生物量的影響。

由圖5可知，谷氨酸棒桿菌對低頻率低能量的超聲耐受能力很強，在不同的處理模式下菌體生物量都有明顯的增長，但在處理模式開10 s停30 s模式下，效果最好，菌體生物量增加了46%。這可能是因為對數期菌體生長旺盛，超聲處理的影響較小，且超聲波可以將微生物在培養過程中形成的細胞束松散開來，提高了菌體對營養物質的利用，從而促進了菌體的生長繁殖，提高了微生物的生物量。

圖5 超聲模式對菌體生物量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic pattern on the biomass of bacteria

2.2 超聲對谷氨酸棒桿菌產L-異亮氨酸的影響

在單因素基礎上，設計L16(54)正交試驗，以L-異亮氨酸生成量為評價標準，結果見表2。

由正交試驗結果可知，因素1均值2最大，即在對數生長期超聲細胞菌體產異亮氨酸最好；因素2均值2最大，即超聲功率為80 W/L產酸效果最好；因素3均值1最大，即超聲頻率為18 kHz產酸效果最好；因素4均值1最大，超聲時間2 h對產酸最有利；因素5均值1最大，說明超聲模式為開10 s停10 s產酸效果最好。對比表2極差數值發現，影響L-異亮氨酸產量的主要因素是對菌體超聲階段的選擇，剩下依次的超聲功率、超聲頻率、超聲模式，最后是超聲時間對L-異亮氨酸產量的影響。

表2 正交實驗結果Table 2 Orthogonal experimental results

對比生物素與L-異亮氨酸最優超聲條件，使用綜合平衡分析法分析得出最終超聲發酵條件，如表3所示。由表2可知，超聲周期的極差達到了11.650，說明影響產酸量的最大因素是超聲周期，對比產酸與生物量發現最優超聲條件都是在對數生長期，同時超聲功率一致在80 W/L產酸量與生物量都達到最高選擇；在超聲頻率最優條件上，生物量與產酸量不同，但18 kHz或26 kHz對L-異亮氨酸產量的均值相差不大，同時考慮到頻率越低，超聲產生的空化泡的數量越大，空化越強烈，菌體受損越嚴重，因此選擇26 kHz超聲頻率；在超聲時間和超聲模式上，生物量與產酸量的最優條件也相差很大，但對于產酸條件來說，極差分別為1.775和2.075，都是次要因素，為保證生物量，增加具有產酸能力的菌體量基數，超聲條件趨向于生物量最優條件，即超聲時間為6 h，超聲模式為開10 s停30 s。

表3 超聲對生物量與L-異亮氨酸對比結果Table 3 Comparison results of biomass and L-isoleucine by ultrasound

2.3 超聲對跨膜行為的影響

細胞在不同生長時期攝取外源Ca2+的能力與胞外Ca2+的跨膜傳導能力有關。超聲處理對數生長期細胞，探究不同超聲時間后，細胞膜內外兩側Ca2+濃度變化。

取超聲結束后對數生長期的細胞，Fura-4/AM負載后，測定胞內熒光強度變化，用負載后的溶液在激光波長652 nm處比較熒光強度，胞內Ca2+濃度與熒光強度成正比，如圖6所示，隨著超聲時間的增加，胞內Ca2+濃度不斷升高，在超聲6 h達到最高，比未超聲前胞內Ca2+濃度增加了75%，細胞膜與外界物質交換頻繁，有利于胞外Fluo-4/AM熒光探針的進入；隨后超聲時間的延長熒光強度逐漸減弱，超聲時間過長改變了菌體正常生長環境，導致細胞產生應激反應，與胞外的物質和能量交換速率下降，造成Fluo-4/AM熒光探針的負載量減少，致使熒光強度下降。總的結果來看，超聲處理增加了細胞膜的通透性，加速了細胞膜兩側的流動性，同時跨膜Ca2+濃度對于刺激膜蛋白活性及維持細胞膜骨架的穩定性非常重要。

圖6 超聲時間對細胞膜通透性的影響Fig.6 Influence of ultrasound time on membrane permeability

2.4 超聲對酶活的影響

超聲功率是影響L-異亮氨酸產量的第二大因素，探究不同超聲功率下隨著超聲時間的增長L-蘇氨酸脫氨基酶的活性變化如圖7所示。

圖7 超聲時間與功率對酶活的影響Fig.7 Effects of ultrasonic time and power on enzyme activity

由圖7可知，L-蘇氨酸脫氨基酶活性隨超聲時間先增強后減小，大約在超聲4 h前后達到峰值，且超聲時間4 h，超聲功率為80 W/L時，L-蘇氨酸脫氨基酶活性最強，達到(0.27±0.02)U/mL；隨著超聲功率的增強，L-蘇氨酸脫氨基酶的活性先上升，隨后在80 W/L達到頂點后快速下降，酶活分別降至(0.18±0.01)U/mL(100 W/L)、(0.16±0.01)U/mL(20 W/L)。同時，低功率超聲隨著超聲時間的增加下降趨勢最為平穩，說明低強度超聲在細胞表面瞬間造成微傷，使細胞壁局部破裂，改變了細胞膜的通透性，加速了細胞內外物質交換，但因為其強度不夠，超聲所造成的細胞表面的傷口較小，細胞可正常修復。

2.5 超聲對菌體形態的影響

發酵3 h后經過26 kHz，80 W/L 超聲處理谷氨酸棒桿菌對數1 h 后(其余處理條件均相同)，比較超聲處理的谷氨酸棒桿菌和未處理的菌體形態如圖8所示。谷氨酸棒桿菌的顯著特征是前期菌體擴培階段菌體分散，菌體小而近圓型，以分裂擴培為主要目的，中期菌體需要轉換菌體形態，轉為產酸形態，菌體粗壯呈橢圓型，菌體多為“八”字形態。而未進行超聲處理的菌體小而圓，以分裂增殖為主，菌液經過超聲處理后，菌體數量明顯增多，且菌體大而粗壯，活力強，利于產酸。超聲加速了菌體的增殖并提前實現菌體“形態轉換”，產酸提前，菌體產酸能力得到加強。

a-未超聲；b-超聲圖8 未超聲與超聲的菌體形態Fig.8 Morphology of bacteria without ultrasound and ultrasound

2.6 超聲對菌體生物量、產酸能力及葡萄糖消耗的影響

由前期工作可以得出綜合生物量與L-異亮氨酸雙重考慮的超聲標準，為在谷氨酸棒桿菌適應期、對數生長期和平穩期，用80 W/L、18 kHz罐內分別連續超聲2、6、1 h，超聲模式設置為每超聲10 s，停30 s，循環往復。由此設計對比實驗，以未超聲條件發酵為對照組，最優超聲條件發酵為優化組，繪制生物量與L-異亮氨酸生成量過程曲線，探究罐內超聲結果的優越性。

由圖9-a對照組生物量曲線可以看出，超聲后發酵適應期幾乎消失，菌體發酵適應階段縮短至2 h以內，菌體快速進入對數生長期；同時對數生長期從2 h延續到24 h，且24 h菌體生物量達到了39.4 g/L，比對照組增加了35.7%；幾乎無衰亡期，直至40 h結束菌體活力依舊很強，最終菌體量達到了41.0 g/L，比對照組提高了74.5%。由圖9-a優化組L-異亮氨酸產量曲線可以看出，超聲優化后產酸提前了2 h，并且在對數生長中后期及平穩期，L-異亮氨酸產量增長趨勢明顯，由于谷氨酸棒桿菌產L-異亮氨酸為生長偶聯型，高生物量有利于產酸速率的提升，最終L-異亮氨酸產量達到了39.0 g/L，比對照組產酸量提升了69.6%。

由圖9-b可知，超聲后葡萄糖消耗量達到了482 g/L，比未超聲多消耗了41.97%；但葡萄糖對菌體轉化率及L-異亮氨酸轉化率上升顯著(P<0.05)，在10 h，葡萄糖對菌體轉化率達到最大，超聲后葡萄糖對菌體轉化率比未超聲增加了14.92%，菌體活力旺盛；同時對比葡萄糖對L-異亮氨酸轉化率曲線，超聲后葡萄糖轉化率在第20 h達到最大值，延長了2 h，轉化率為0.397 g/g，比未超聲增加了13.75%，且超聲20 h后，葡萄糖對L-異亮氨酸轉化率曲線下降速率平緩，加強了菌體后期產酸能力。

a-實心代表生物量，空心代表L-異亮氨酸產酸量;b-實心代表葡萄糖消耗量，空心代表葡萄糖對菌體轉化率，左空右實代表葡萄糖對L-異亮氨酸轉化率圖9 超聲與未超聲對生物量與L-異亮氨酸生成量及對葡萄糖消耗量與轉化率的影響Fig.9 Effects of ultrasound and non-ultrasound on biomass and L-isoleucine production and glucose consumption and conversion

3 結論

在發酵過程中用超聲作為物理手段處理發酵液，對于谷氨酸棒桿菌發酵產L-異亮氨酸效果顯著，其超聲周期、超聲功率、超聲頻率、超聲時間和超聲模式都會對菌體的增殖及產酸能力都有很強的提升能力。谷氨酸棒桿菌超聲發酵的最優條件為：用80 W/L、26 kHz超聲波，在菌體適應期、對數生長期及平穩期分別超聲2、6、1 h，超聲模式設置為開10 s、停30 s。超聲形成的流體微擾動，使發酵液中分子活性提高，可以增加細胞內外物質的交換速率，有利于菌體的生長，結果顯示，直至40 h結束菌體活力依舊很強，最終菌體量達到了41.0 g/L，比未超聲提高了74.5%；超聲形成的機械切向力，在細胞表面瞬間造成微傷，使細胞壁局部破裂，改變了細胞膜的通透性，加速了細胞內外物質交換，解除了胞內產物濃度過高而產生終產物抑制，最終L-異亮氨酸產量達到了39.0 g/L，比未超聲產酸量提升了69.6%。