基于Illumina MiSeq測序和傳統可培養方法的洪湖鲊廣椒乳酸菌多樣性研究

李娜，崔夢君，馬佳佳，雷炎，郭壯，張振東

(湖北文理學院 食品科學技術學院，鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北 襄陽，441053)

鲊廣椒是一種以玉米面或大米面或同時2種面粉與鮮辣椒混合作為主料，輔以鹽、胡椒粉和花椒等輔料密封發酵制成的一種傳統發酵食品，深受我國四川、重慶、貴州、云南以及湖北等省市地區人民的喜愛[1]。洪湖市位于湖北省荊州市，該地區湖泊眾多，地理環境獨特，出產的鲊廣椒口感酸辣，風味較為特別。由于制作的環境較為開放，鲊廣椒中的微生物多樣性易受到地區環境與制作工藝的影響[2]，推測風味獨特的洪湖鲊廣椒中可能蘊含著一些獨特的微生物類群。

近些年，Illumina MiSeq高通量技術由于具有測序通量高、檢測速度快和靈敏度高的特點，倍受研究人員的喜愛，被廣泛應用于辣椒醬[3]、臘肉[4]、黃酒[5]以及大頭菜[6]等食品中微生物群落結構組成研究。第二代測序技術Illumina MiSeq平臺不僅降低了測序成本還增加了樣品的測序深度，并且具有精確度高和測序量大等特點[7-9]，能更加真實地反映發酵食品中微生物群落的結構[10]。既往研究發現多數鲊廣椒的乳酸菌相對含量較高，并且添加乳酸菌還可以改善鲊廣椒的風味和滋味[11-13]。然而，目前少有對于風味與制作環境較為獨特的洪湖鲊廣椒的研究報道，對其中蘊含的乳酸菌菌種資源仍不可知。

由于乳酸菌是目前食品領域使用的重要菌種資源，本研究擬同時采用傳統可培養方法與MiSeq高通量技術對鲊廣椒中乳酸菌多樣性進行解析，明確洪湖鲊廣椒中的乳酸菌群落組成以及特色菌群，以期為洪湖地區鲊廣椒中乳酸菌菌種資源的保存、開發與利用提供實驗依據，更可為鲊廣椒的產業化提供優質的乳酸菌資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從湖北省荊州市洪湖市農貿市場采集不同農戶自制鲊廣椒共7份，分別編號為HH1、HH2、HH3、HH4、HH5、HH6和HH7，置于含有冰袋的采樣箱中迅速運回實驗室進行分裝，1份于-70 ℃貯存，用于高通量測序；另1份用于乳酸菌的分離。

dNTPs Mix、FastPfu Fly DNA Polymerase、5×TransStartTM FastPfu Buffer，北京全式金生物技術有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒，德國QIAGEN公司；克隆載體pMD18-T，大連寶生物工程有限公司；MRS培養基(酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、檸檬酸二胺、KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、NaAc、葡萄糖和吐溫-80，均為分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂糖，索來寶生物技術有限公司；瓊脂粉，北京奧博星生物技術有限公司；PCR清潔試劑盒，Axygen生物技術(杭州)有限公司。

1.2 儀器與設備

Veriti FAST梯度PCR儀，美國ABI公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統，美國ProteinSimple公司；HR40-IIB2生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司；DG250厭氧工作站，英國DonWhitley公司；LRH-250生化恒溫培養箱，上海力辰儀器科技有限公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺，美國Illumina公司；ND-2000C微量紫外分光光度計，美國Nano Drop公司；離心機，德國Eppendorf公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 鲊廣椒中微生物宏基因組DNA提取

按照基因組DNA提取試劑盒說明書提取鲊廣椒樣品的宏基因組DNA，將通過瓊脂糖凝膠電泳與微量紫外分光光度計檢驗合格的DNA置于-20 ℃中暫存，備用。

1.3.2 鲊廣椒樣品的高通量測序

以提取到的鲊廣椒樣品總DNA為模板，使用加入了成對堿基核苷酸標簽的338F/806R引物，參照王玉榮等[14]的PCR擴增體系和擴增條件對鲊廣椒樣品中的細菌16S rRNA V3～V4區進行PCR擴增。使用的引物為：338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。將擴增產物用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后的PCR擴增產物在Illumina MiSeq PE300高通量測序平臺進行高通量測序。

1.3.3 序列拼接和質量控制

參照王玉榮等[15]的方法對下機后的數據進行拼接和質控，去除不合格的序列(重疊區堿基數≤10 bp，引物錯配數≥2 bp且去除引物后序列長度≤50 bp的序列)后，使用質控后的優質序列進行生物信息學分析。

1.3.4 生物信息學分析

參照郭壯等[16]的方法，對質控后的序列在QIIME分析平臺進行生物信息學分析。首先將序列進行標準比對和對齊，分別以100%和97%相似度進行兩步UCLUST劃分，從而建立分類操作單元(operational taxonomic units，OTU)；接下來剔除含有嵌合體的OTU序列，選取代表性序列在GREENGENE和RDP數據庫中進行同源性比對，從而在門、綱、目、科和屬水平上對樣品中的細菌進行解析；計算Chao1指數、Simpson指數和Shannon指數從而對樣品中微生物的多樣性和豐度進行評價。

1.3.5 鲊廣椒中乳酸菌的分離純化

取10 g鲊廣椒樣品，移入含90 mL無菌生理鹽水的三角瓶，然后充分振蕩混勻。將樣品做10倍的梯度稀釋。完成后，吸取50～100 μL的樣品稀釋液(稀釋度為10-3、10-4、10-5)均勻的涂布于碳酸鈣質量濃度為10 g/L的MRS固體平板上，置于30 ℃厭氧工作站[V(N2)∶V(CO2)∶V(H2)=85∶10∶5]中培養72 h。隨后挑選大小、顏色、形態均不相同且有透明圈的單菌落進行至少3 次劃線純化，并將革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性的乳酸菌使用含有30%(體積分數)甘油的MRS液體培養基重懸，然后凍存于-80 ℃超低溫冰箱，待用。

1.3.6 鲊廣椒中乳酸菌的鑒定

使用CTAB法提取乳酸菌的DNA[17]，參照郭壯等[18]的擴增方法進行PCR擴增，并對擴增產物進行檢測、清潔、連接、轉化和克隆子的鑒定，挑選出陽性克隆子送至武漢天一輝生物有限公司進行測序。將返回來的測序序列用軟件DNAMAN拼接，手動去引物后，在美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數據庫中進行BLASTn比對，選取序列相似度≥99%的16S rRNA模式菌株序列，使用軟件MEGA 5.0中的鄰接法(neighbor joining，NJ)構建系統發育樹，確定分離到的乳酸菌的系統分類地位。

1.3.7 數據處理

使用軟件MEGA 5.0中的NJ構建系統發育樹，并用Adobe Illustrator軟件導出系統發育進化樹；采用相關性分析法對鲊廣椒樣品中平均相對含量>1.0%的優勢細菌門和屬進行相關性研究；使用R軟件(v3.5.3)和軟件Origin 2017繪圖。

2 結果與分析

2.1 洪湖鲊廣椒細菌多樣性指數分析

本研究采集了7份洪湖鲊廣椒樣品，通過Illumina Miseq高通量測序技術對洪湖鲊廣椒樣品細菌多樣性進行了解析。通過生物信息學技術對鲊廣椒樣品的細菌多樣性分析結果如表1所示。

表1 洪湖鲊廣椒樣品的測序數量與細菌多樣性分析Table 1 Sequencing quantity and bacterial diversity analysis of Honghu Zha-chili

由表1可知，高通量測序共產生了259 663 條高質量序列，平均每個樣品37 095條。按照100%和97%相似度對序列進行劃分且去除嵌合體后共得到8 398個OTU。HH6樣品的Chao1指數和Shannon指數均最大，分別為1 195和7.03，由此可見，HH6樣品細菌微生物的豐富度最大且多樣性最高，細菌群落結構組成可能最為復雜。

2.2 洪湖鲊廣椒細菌群落結構分析

在對樣品序列豐富度和多樣性分析的基礎上，進一步對質控合格的序列進行了鑒定，共鑒定出36個門，96個綱，137個目，204個科和403個屬，其中僅有0.11%和6.02%的序列鑒定不到門和屬水平。將本研究的鲊廣椒樣品中平均相對含量>1.0%的門和屬定義為優勢門和優勢屬，鲊廣椒樣品中平均相對含量>1.0%的優勢細菌門組成如圖1所示。

圖1 洪湖鲊廣椒中的優勢細菌門Fig.1 Dominant phylum in Honghu Zha-chili

由圖1可知，鲊廣椒樣品中細菌平均相對含量>1.0%的細菌門有4個，分別是硬壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)，其平均相對含量分別為77.78%、18.09%、1.74%和1.51%。值得一提的是，硬壁菌門在樣品HH3、HH4和HH7中較高，相對含量分別為98.71%、98.40%和99.49%。洪湖鲊廣椒中的共有優勢菌門為硬壁菌門、變形菌門和放線菌門，累計平均相對含量超過了97.38%。

同樣的，本研究在屬的分類水平上對鲊廣椒樣品中的細菌進行了分析，結果如圖2所示。

圖2 洪湖鲊廣椒中的優勢細菌屬Fig.2 Dominant bacteria genera in Honghu Zha-chili

由圖2可知，洪湖鲊廣椒中優勢細菌屬共有7個，分別是隸屬于硬壁菌門的乳桿菌屬(Lactobacillus)和海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)，其平均相對含量分別為67.97%和3.88%；隸屬于變形菌門的鹽單胞菌屬(Halomonaas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、雷爾氏菌屬(Ralstonia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和草螺菌屬(Herbaspirillum)，平均相對含量分別為3.47%、1.83%、1.75%、1.53%和1.02%。乳桿菌屬在樣品HH1、HH3、HH4和HH7中含量最高，相對含量均超過了85%。由此可見，洪湖鲊廣椒樣品中主要的細菌是隸屬于硬壁菌門的乳桿菌屬。

本研究中的高通量測序數據共產生了8 398個OTU，進一步對平均相對含量>1.0%的優勢OTU進行了分析。平均相對含量>1.0%的OTU如圖3所示。

由圖3可知，洪湖鲊廣椒樣品中含12個平均相對含量>1.0%的OTU，分別是OTU3336、OTU4099、OTU5847、OTU1749、OTU357、OTU2214、OTU5962、OTU1973、OTU7126、OTU7065、OTU6541和OTU4775，其平均相對含量分別為3.30%、1.20%、1.60%、1.66%、1.80%、2.01%、2.89%、3.75%、5.31%、8.12%、8.78%和12.83%。經序列比對分析發現，OTU3336隸屬于鹽單胞菌屬；OTU4099隸屬于海洋芽孢桿菌屬；OTU5847隸屬于雷爾氏菌屬；OTU1749、OTU357、OTU2214、OTU5962、OTU1973、OTU7126、OTU7065、OTU6541和OTU4775隸屬于乳桿菌屬。由此可見，基于屬水平及OTU水平的分析均表明，乳桿菌屬仍然是洪湖地區鲊廣椒樣品中的優勢細菌。

圖3 平均相對含量大于1.0%的OTU方塊圖Fig.3 OTU block diagram with average relative content greater than 1.0%

乳酸桿菌最初在1986年被描述，到2019年為止一共建立了289個種水平的分類單元[19]。乳酸桿菌被認為是安全的，可用于食品行業的微生物中，乳酸桿菌占了很大比例。在當陽[20]、恩施[21]、荊州[22]等多個地區的鲊廣椒中，乳桿菌屬都是優勢屬，可能對食品的滋味和風味形成具有重要影響[13,23]。洪湖鲊廣椒中乳酸桿菌對其特色風味物質的作用仍有待于進一步研究。

2.3 乳酸菌的分離與系統分類

由高通量測序可知，洪湖鲊廣椒樣品中的乳酸菌以乳酸桿菌為主，而乳酸桿菌在食品等領域具有重要的應用價值，因此接下來對洪湖鲊廣椒中的乳酸菌進行了分離與鑒定。本研究使用碳酸鈣含量為10 g/L的MRS平板對洪湖鲊廣椒樣品中的乳酸菌進行了分離，并使用平板劃線法進行純化。將具有透明圈，革蘭氏染色為陽性，且過氧化氫酶陰性的菌株初步判定為乳酸菌[24]。從7份洪湖鲊廣椒樣品中共分離出29 株疑似乳酸菌菌株，均是桿菌，其特征描述見表2。

表2 洪湖鲊廣椒樣品來源的乳酸菌菌落形態Table 2 Colony morphology of lactic acid bacteria from Honghu Zha-chili

本研究對獲得的29 株疑似乳酸菌進行了基因組DNA提取，細菌16S rRNA基因的PCR擴增、TA克隆與測序，將返回來的序列經手動拼接和去引物后，通過NCBI數據庫進行BLASTn比對。選取序列相似度達到99%以上的16S rRNA模式序列構建系統發育樹，基于16S rRNA基因序列構建的系統發育樹如圖4所示。

由圖4可知，菌株HBUAS56267、HBUAS56268、HBUAS56272、HBUAS56274、HBUAS56276、HBUAS56279、HBUAS56280和HBUAS56282與模式菌株LactobacillusfutsaiiJCM 17355的系統發育關系最近，其16S rRNA序列相似度超過了99%，被鑒定為福萊乳桿菌(L.futsaii)；菌株HBUAS56258、HBUAS56259和HBUAS56260與模式菌株LactobacilluszhachiliiHBUAS52074的系統發育關系最近，被鑒定為鲊廣椒乳桿菌(L.zhachilii)；菌株HBUAS56257和HBUAS56275與模式菌株L.paralimentariusJCM 10415的在系統發育樹上形成了一個分支，被鑒定為類消化乳桿菌(L.paralimentarius)；菌株HBUAS56264、HBUAS56266和HBUAS56286與模式菌株L.alimentariusDSM 20249的系統發育關系最近，被鑒定為消化乳桿菌(L.alimentarius)；菌株HBUAS56256、HBUAS56261、HBUAS56262、HBUAS563、HBUAS56269、HBUAS56270、HBUAS56273、HBUAS56277、HBUAS56278和HBUAS56284被鑒定為植物乳桿菌(L.plantarum)；菌株HBUAS56265與模式菌株PediococcusethanoliduransZ9位于系統發育樹的同一分支上，因而被鑒定為耐乙酸片球菌(P.ethanolidurans)；菌株HBUAS56271與模式菌株L.acidipiscisNBRC 102163的系統發育關系最近，被鑒定為酸魚乳桿菌(L.acidipiscis)；菌株HBUAS5628被鑒定為綠色魏斯氏菌(Weissellaviridescens)。

圖4 基于16S rRNA序列的洪湖鲊廣椒來源的乳酸菌鄰接法系統發育樹Fig.4 NJ phylogenetic tree of lactic acid bacteria from Honghu Zha-chili based on 16S rRNA sequence

總的來說，本研究從洪湖鲊廣椒樣品中共分離出來29株乳酸菌，鑒定為3個屬和8個種，其中有植物乳桿菌(L.plantarum)10 株，福萊乳桿菌(L.futsaii)有8株，分別占總分離菌株數的34.48%和27.59%。因此，洪湖地區鲊廣椒中除植物乳桿菌外，還含有較高比例的福萊乳桿菌(L.futsaii)，可能是洪湖地區鲊廣椒的特色細菌類群，而該結果與鄧風[25]、雷炎[21]與葛東穎等[22]對鲊廣椒的研究結果并不一致。

3 結論

本研究采用Illumina Miseq高通量測序技術結合傳統可培養方法對7 份洪湖地區鲊廣椒樣品中乳酸菌多樣性進行了解析。研究發現，硬壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門是洪湖鲊廣椒的優勢細菌門；乳桿菌屬、海洋芽孢桿菌屬、鹽單胞菌屬、不動桿菌屬、雷爾氏菌屬、假單胞菌屬和草螺菌屬是洪湖鲊廣椒的優勢細菌屬，其中乳桿菌屬含量最高。此外，研究發現從洪湖鲊廣椒樣品中分離出來的29 株乳酸菌中植物乳桿菌有10株，福萊乳桿菌有8株，分別占總分離菌株數的32.26%和25.81%，后者可能為洪湖鲊廣椒樣品中的特色優勢菌群。