傳統隴西臘肉制作過程中揮發性風味物質變化分析

毛永強，李彥虎，贠建民，何奎，王睿，武淑娟

(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)

隴西臘肉是一種甘肅傳統發酵肉制品，已有300多年的歷史，是以漳縣、岷縣一帶蕨麻豬的五花肉為原料，添加食鹽、花椒、冰糖、小香、姜皮、桂皮、草果、豆蔻、桂籽、大香等十多種輔料，在冬臘月以傳統方式腌制而成[1]。隴西臘肉滋味純美，瘦肉紅燦，肥膘晶瑩，香味濃郁而不膩，深受西北民眾的喜愛[2]。但工藝落后、技術理論尚不完善已成為制約隴西臘肉發展的因素[3]。在工藝現代化改進過程中，如何保持傳統產品的良好風味至關重要。

發酵肉制品的風味物質主要包括揮發性和非揮發性兩大類，且揮發性化合物對制品整體風味起關鍵性作用[4]。就目前研究進展來看，揮發性風味成分的形成途徑有3種，分別是Maillard 反應[5]，營養物質代謝[6-8]和微生物發酵作用[9-11]。對發酵肉制品中揮發性風味物質的研究已有不少報道，如郭昕等[12]檢測了3種不同類型臘肉的揮發性風味成分時發現，各臘肉間既含共有香氣成分，又含特征香氣成分；宋永等[13]檢測哈爾濱風干腸時發現，其關鍵風味化合物是己酸乙酯、乙醇、己醛和丁酸乙酯；李鑫等[14]利用吹掃捕集/頂空固相微萃取-氣質聯用分析金華火腿揮發性風味物質，共檢測出106種揮發性風味物質；趙改名等[15]研究發現金華火腿風味物質是在加工過程中逐步形成的，且不同階段風味物質的含量及其比例各具特征。

不同類型的發酵肉主體風味成分不同，風味物質種類繁多，但并非所有的揮發性物質都對產品的風味有貢獻，氣味活性化合物的確定是食品風味研究的熱點和重點。目前，關于隴西臘肉風味的研究已有報道，師希雄等[16]采用氣相-質譜分析檢測了隴西臘肉中的風味，共檢測出42種揮發性物質，發現萜烯類、醛類、含硫含氮及雜環類物質等共同組成隴西臘肉的風味基礎。但關于傳統隴西臘肉在制造過程中氣味活性物質演變規律及關鍵風味物質尚不明確，使得隴西臘肉在現代化工業生產中風味控制技術的研發缺乏理論指導。

為此，本試驗利用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術(solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS)技術對傳統隴西臘肉制作過程中揮發性組分進行動態跟蹤檢測分析，以期明確隴西臘肉制作過程中揮發性物質的變化規律，并明晰關鍵風味物質，為今后隴西臘肉加工過程中風味形成及調控提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隴西臘肉：采自于甘肅省隴西縣大胡子傳統臘肉生產基地。

試劑：2-辛醇(色譜級)，美國 Sigma 公司；NaCl(分析純)，購置于天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 7000D 安捷倫三重串聯四級桿氣質聯用儀(配有 EI 離子源和NIST MS 數據處理系統)，美國 Agilent 公司；PAL3 自動三合一進樣器系統，美國 Agilent 公司；SW-CJH-2FD超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集

臘肉樣品采自于甘肅隴西大胡子臘肉生產基地，跟蹤采集隴西臘肉一個批次生產完整過程。根據隴西臘肉制作過程關鍵時間節點，確定5個采樣時間點(表1)，采樣完成后樣品置于冰盒內當天運回實驗室進行分樣，每份樣品不少于2.5 kg。每個時間點需要采集3個平行樣品，然后充分混合均勻，準確稱取樣品分裝于若干個無菌取樣管，并按照不同采樣時期編號，以上過程均在超凈工作臺內完成，經液氮冷凍后存于-80 ℃冰箱，以備進行相關指標的測定，樣品具體分組信息如表1所示。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

1.3.2 揮發性風味檢測

(1)萃取條件：參照師希雄等[16]方法并做修改，具體過程為：準確稱取10 g臘肉樣品、2 g NaCl于20 mL配有硅膠密封墊圈的玻璃瓶內，在70 ℃水浴鍋加熱平衡10 min。然后將頂空萃取頭插入玻璃瓶內，推出纖維頭進行頂空萃取。萃取時間為30 min，萃取完成后，于245 ℃的GC-MS進樣口解吸10 min。萃取不同樣品需老化萃取頭，老化時間3 min。

(2)GC條件：參照師希雄等[16]方法并做修改，使用毛細管色譜柱OV-1701(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)，起始溫度30 ℃，保持1 min，以5 ℃/min的速率上升至180 ℃保持3 min，以4 ℃/min升溫至200 ℃，保持6 min，以20 ℃/min升溫至245 ℃，保持15 min；載氣(He)，流速1.0 mL/min。不分流進樣。

(3)MS條件：參照師希雄等[16]方法并做修改，EI離子源：70 eV，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度為250 ℃，四級桿溫度為150 ℃，掃描質量m/z為40～600。

按匹配度大于800，采用質譜NIST譜庫檢索比對定性分析。采用內標法進行半定量分析，內標為2-辛醇，質量濃度為88.01 μg/L。風味物質含量計算如公式(1)所示：

(1)

式中：X表示揮發性風味成分的質量濃度，μg/L；f代表內標物的校正因子，值為1；A表示揮發性風味成分的相對峰面積百分比；C表示添加內標物的質量濃度；A0為測得內標物的相對峰面積。

(4)關鍵揮發性物質評價

參照劉登勇等[17]方法并做修改。樣品中關鍵揮發性風味物質采用相對氣味活度值(relative odor activity value，ROAV)分析法確定。在此之前，需要先確定對樣品風味貢獻最大的揮發性組分。

鑒于此，本研究采用氣味活度值(odor activity value, OAV)方法，即嗅感物質的絕對濃度(C)與其感覺閾值(T)之間的比值，計算如公式(2)所示：

(2)

根據(2)式定義，我們規定對樣品風味貢獻最大的揮發性組分ROAVmax=100，其他揮發性組分ROAV值計算如公式(3)所示：

(3)

式中：Ci和Cmax分別表示各揮發性組分的相對含量(%)和對樣品總體風味貢獻最大揮發性組分的相對含量(%)，Ti和Tmax表示各揮發組分的感覺閾值(μg/L)和對樣品總體風味貢獻最大組分的揮發性組分的感覺閾值(μg/L)，對樣品總體風味的貢獻越大，揮發性組分的ROAV值一般越大。

1.3.3 感官評價

參照孔曉雪等[18]方法，并做修改。選擇10位無飲食偏好的人員且經過專業訓練，組成感官評價小組，將各時期樣品分開蒸熟，切成厚度為0.5 cm的切片，分別以肉色、口感、氣味、滋味、組織狀態5項指標對不同時期臘肉樣品品質進行評定，以此確定制作過程中感官品質的變化。評分表見表2。

表2 感官評價標準表Table 2 Standards for sensory evaluation

1.4 數據處理

使用Microsoft Excel 2010和Origin 9.0對數據進行統計處理和繪制圖表，利用Heatmap軟件進行風味熱圖可視化，SPSS 19.0 進行顯著性差異及主成分分析。

2 結果與分析

2.1 各時期揮發性化合物種類及含量變化

傳統隴西臘肉制作過程中揮發性化合物種類及含量變化如圖1、表3所示，各揮發性物質中除酸類物質外，其余各類揮發性化合物隨工序的進行均呈上升趨勢。各時期共檢測出81種揮發性化合物，其中烴類13種，主要是苯乙烯；醛類19種，主要是己醛；酯類11種，主要是辛酸乙酯；醇類14種，主要為1-辛烯-3-醇；有機酸11種，主要是癸酸、己酸；酮類8種，主要是苯乙酮、3-羥基-2-丁酮；其他5種。按時期分：原料期(T0)58種，總含量1 362.06 μg/kg；腌制中期(T15)69種，總含量2 584.38 μg/kg；腌制后期(T30)79種，總含量4 473.05 μg/kg；風干期(T60)77種，總含量2 255.84 μg/kg；成熟期(T90)76種，總含量2 926.59 μg/kg。臘肉中揮發性化合物含量的高低并不能代表其對風味貢獻度的大小，要確定其對臘肉風味貢獻的大小，還需進一步分析。

表3 各時期樣品中揮發性物質GC-MS檢測結果Table 3 GC-MS results of volatile compounds in samples of different periods

續表3

圖1 各時期樣品中揮發性物質種類變化Fig.1 Variation of volatile substances in samples of different periods

2.2 揮發性化合物聚類分析

為進一步確定各時期的香氣成分特點，將揮發性化合物進行熱圖分析，結果見圖2。不同制作時期的樣品中揮發性物質的組成及含量存在較大的差異。根據熱圖中不同時期揮發性物質的聚類分析可知，樣品T30與樣品T60以及樣品T90聚在一起，說明腌制后期與風干中期以及成品肉中揮發性物質的組成及含量相似。而且，T30、T60、T90樣品中熱圖顏色以灰綠色、暗紅色為主，并且，藍紫色較少，說明揮發性物質主要形成于隴西臘肉制作的中后期。

圖2 樣品中揮發性物質含量熱圖Fig.2 Heat map of volatile substances in samples注：熱圖中藍紫色表示風味物質含量為零，顏色由綠色向紅色表示風味物質含量由低到高的變化

2.3 樣品ROAV分析

發酵肉的揮發性化合物中，對香氣起主要貢獻作用的通常僅是一小部分化合物。為進一步挖掘隴西臘肉中對風味有重要貢獻的主體揮發性化合物，基于OAV法和ROAV法并結合揮發性物質感覺閾值對其進行篩選，根據每組樣品的平均值確定ROAV評分。

結果如表4所示，ROAV值為1～100的物質總共有22種，ROAV值在0.1～1共有8種。其中ROAV≥1的烴類物質主要是D-檸檬烯、苯乙烯、月桂烯；醛類物質主要是3-甲基丁醛、辛醛、(E)-2-壬烯醛、己醛、壬醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E)-2-辛烯醛、(E)-2-庚烯醛、庚醛；脂類物質主要是己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸香葉酯、乙酸乙酯；醇類物質主要是1-辛烯-3-醇和芳樟醇；酮類物質主要是2,3-辛二酮，除此之外，還有2-戊基呋喃、茴香醚。初步證明這些化合物是臘肉制作過程中對風味起主要貢獻的物質。另外，由于烷烴、有機酸類物質感覺閾值比較高，對風味貢獻作用不明顯。

表4 隴西臘肉中關鍵揮發性風味物質確定Table 4 Determination of key volatile flavor substances of Longxi bacon

2.4 樣品主成分分析

主成分分析方法主要研究ROAV≥1的風味物質，并提取主成分特征值不小于1的主成分，所得結果如表5所示,前3個主成分的累積方差貢獻率為86.49%。

表5 主成分特征值及方差貢獻率Table 5 principal component eigenvalues and variance contribution rates

圖3-A、圖3-B為隴西臘肉制作過程中關鍵性風味物質的主成分載荷圖。分別以第一主成分為橫坐標，第二和第三主成分為縱坐標作圖，此圖說明了關鍵的揮發性風味物質對主成分的影響。由表5可知，其第一、第二和第三的方差貢獻率分別是34.98%、31.12%和20.39%。其中，PC1中載荷正向最高的物質S19(己酸乙酯)，載荷負向最高的物質為S20(辛酸乙酯)；PC2中載荷正向最高的物質為S16(己醛)，負向最高的物質為S13(3-甲基丁醛)；PC3載荷正向最高的物質為S28(芳樟醇)，載荷負向最高的物質為S12[(E)-2-辛烯醛]。上述結果說明己酸乙酯、茴香醚、己醛、3-甲基丁醛、(E)-2-辛烯醛和芳樟醇是不同時期樣品中風味物質含量有明顯差異的揮發性物質，能很好的區分各時期的樣品。

圖3 隴西臘肉關鍵揮發性風味物質主成分載荷圖Fig.3 Load diagram of principal components of key volatile flavor substances of Longxi bacon注：圖中字母分別與表4相對應

同時，不同時期的樣品分別位于4個象限，并且主成分1、2、3能很好地區分不同時期的樣品，但風干后期(T60)與成品期(T90)始終位于同一象限，與熱圖(圖2)聚類結果相似，說明這2個時期內關鍵風味物質相似，并且主體風味物質主要在這兩個時期內形成。

2.5 感官評價結果分析

臘肉感官品質直接決定了消費者的飲食偏好。因此，開展感官評價對于把握其品質變化顯得尤為重要。由表6、圖4可知，隴西臘肉總體感官評分隨著制作過程進行逐漸增加，其中成品肉評分最高為 95.3分，說明隨著制作過程的變化和時間延長，臘肉品質日益良好，尤其表現在肉色、口感、氣味、組織狀態方面，但滋味評分在腌制期內(T15、T30)有所降低，這是由于腌制期內氯化鈉分布不均勻，導致肉胚內、外層咸味不均一所致。

表6 感官評分結果 單位：分Table 6 Sensory score results

圖4 感官評價雷達圖Fig.4 Sensory evaluation radar map

3 討論

傳統隴西臘肉制作過程中的揮發性化合物的變化情況不同。檢測出的醛類物質在種類(19種)和含量(4 162.13 μg/kg)上都是最豐富的，主要是己醛、辛醛、壬醛、3-甲基丁醛和(E)-2-庚烯醛等，這些物質的含量在臘肉制作過程中變化趨勢不同，其中己醛在腌制中期(T30)時含量最高，壬醛則在成熟期(T90)時含量最高。研究發現，醛類物質主要是脂肪氧化產生[20]，己醛主要是亞油酸和花生四烯酸的產物[21]，而壬醛則是油酸氧化產生[22]，己醛和壬醛分別具有青香味和脂肪味，對臘肉風味有重要貢獻。3-甲基丁醛風味閾值很低，只有0.2 μg/kg，且具有堅果香味[23]，對臘肉整體風味有重要貢獻作用。

醇類物質也是隴西臘肉中含量(2 736.47 μg/kg)較高的化合物，在整個過程中，其含量呈上升趨勢。ROAV分析結果來看，主要風味貢獻物質是1-辛烯-3-醇和芳樟醇。其中，1-辛烯-3-醇閾值較低，是脂肪酸氧化的產物，可賦予臘肉蘑菇味、柑橘和玫瑰氣味，還可增強肉中的脂肪香味[24]，也有研究發現1-辛烯-3-醇是火腿中的重要風味物質[23]。芳樟醇在原料肉(T0)中未發現，在腌制期開始檢出，可能是由于香辛料添加的結果。芳樟醇呈現花香和薄荷香氣，可為臘肉提供良好的風味[25]。但是，醇類風味閾值相對較高，可能對臘肉風味的整體貢獻率較低[24]。

檢出的酮類和酯類物質含量相對較低，在整個過程中，酮類物質呈先增后降的趨勢，酯類物質一直呈上升趨勢。本研究結果顯示，隴西臘肉中酯類物質主要是己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸香葉酯和乙酸乙酯，而這些物質主要呈現菠蘿味等水果味[26]，是隴西臘肉中重要的風味來源，這些酯類物質與廣式臘肉中酯類物質構成相似[12]；酮類物質主要是2,3-辛二酮, 其風味閾值也較低，為3 μg/kg，具有奶油香味，對臘肉香氣形成有重要作用，白衛東等[27]在廣式臘肉中也檢出了此類物質。其他類物質中2-戊基呋喃含量較高，其閾值也相對較低，呈植物芳香味[28]，研究發現2-戊基呋喃是臘肉中都含有的重要風味化合物[29]。

隨著工序變化，隴西臘肉感官品質(肉色、口感、氣味、組織狀態、滋味)日益良好，感官評分結果與揮發性風味物質的組成和變化的變化趨勢基本一致，這表明揮發性風味物質成分和含量的變化直接影響了臘肉的感官特性，是評價臘肉品質的重要指標。傳統隴西臘肉屬自然發酵肉制品，微生物作用也是其制作過程中風味形成的重要因素，這也是后期研究的方向。總之，構成臘肉風味的物質基礎豐富多樣，而且風味形成反應機制復雜，要完全明晰風味形成機理還需進行大量研究。

4 結論

本研究采用SPME-GC-MS技術對傳統隴西臘肉制作過程中的揮發性風味物質的變化進行動態檢測分析，共鑒定出烴類、醛類、酯類、醇類、有機酸、酮類等揮發性成分共81種。在臘肉制作的不同時期(T0、T15、T30、T60、T90)，各種揮發性物質的含量表現出一定的變化規律：揮發性物質總量呈先增高后降低的趨勢，在腌制后期(T30)時達到最高，為4 473.05 μg/kg；樣品中醛類物質含量最高，其次是醇類物質。ROAV分析結果顯示醛類、酮類、酯類物質對風味貢獻最大；主成分分析結果表明己酸乙酯、茴香醚、己醛、3-甲基丁醛、(E)-2-辛烯醛和芳樟醇是各時期樣品中揮發性風味物質含量差異明顯的化合物，能很好的區分各時期的樣品。感官評分結果表明，樣品在各評價指標上的評分隨著加工時期的延長而增高，在成品期 (T90) 時最高，表明傳統隴西臘肉在整個制作過程中風味逐漸變好。