甘草酸纖維茶樹精油乳液凝膠的制備及其結構表征

許夢月，李 青，吳 華，萬芝力,*，楊曉泉

（1.食物蛋白與膠體研究中心，廣東省天然產物綠色加工與產品安全重點實驗室，華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640；2.北京市植物資源研究開發重點實驗室，北京工商大學理學院，北京 100048）

乳液凝膠是油脂結構化常見的形式之一，是指乳化油滴分散在凝膠基質中的一種半固體材料[1]。乳液凝膠可作為結構化油脂代替食品中的固態脂肪，保證食品的口感與質構；可以限制或阻止食品、化妝品中液態油脂的流動和遷移[2-5]。目前，用于制備結構化油脂的分子助劑中，天然的小分子結構助劑具有比半合成/合成的凝膠劑均更高的生物利用度、生物相容性和生物降解能力，更適用于食品、藥品及化妝品領域的油脂結構化[5]。甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）是從甘草根部提取的活性成分，是由三萜糖苷配基（18β-甘草次酸）和雙葡萄糖醛酸組成的酸性植物皂苷，具有兩親性，易溶于熱水[6-7]。本課題組前期研究證明，GA分子可以在水中自組裝形成納米長纖維，當GA質量分數大于0.3%時，可以形成超分子水凝膠[8-9]。另外，GA纖維可以在油-水界面形成多層吸附，進而形成具有高靜電排斥力的纖維殼層[10]。因此，GA納米纖維可用作O/W乳液的穩定劑，并具有作為天然小分子凝膠劑制備半固態乳液凝膠的潛力[6,10]。

植物精油是通過干蒸餾、水蒸餾或溶劑從植物中提取的低分子質量的復雜芳香混合物[11-12]，常溫下一般為油狀液體，故也稱“揮發油”、“芳香油”[13]。茶樹精油是一種具有豆蔻氣味的無色或淺黃色透明油狀液體[14]。茶樹精油具有親脂性，表面張力較低，且難溶于水[15]。此外，茶樹精油具有多種生物活性和功能，可用于抗炎、抗癌、驅蟲和防腐[16-17]，并廣泛應用于醫藥、食品、化妝品等領域[18-19]。目前，國內外對植物精油的膠體包封系統（如乳液、微膠囊、納米乳劑、脂質體等）研究較多[18,20-22]，對精油結構化研究較少。油脂結構化在不同領域的應用潛力很大，尤其當前消費者對醫藥、食品和化妝品行業含有天然成分的產品需求的增加[5,23]，因此開展植物精油結構化的研究將有利于擴展植物精油產品的應用形式和應用范圍。基于此，本實驗選用天然三萜皂苷GA作為結構單元，采用綠色、安全且溫和的制備工藝，利用自組裝GA納米纖維的兩親性及凝膠性對植物精油進行結構化，并探討GA纖維質量分數、茶樹精油質量分數、油相組成對精油乳液凝膠外觀、微觀結構、流變學特性等的影響，旨在為精油結構化材料與方法的探索提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘草酸銨 美國Acros Organics公司；茶樹精油江西寶林天然香料有限公司；尼羅紅、硫代黃素T（thioflavin T，ThT）、硅鎂型吸附劑/弗羅里硅土（Florisil?PR 60～100 目） 美國Sigma-Aldrich公司；葵花籽油 佳格食品有限公司；中鏈甘油三酯（medium chain fatty acid triglycerides，MCT） 上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純；所有實驗用水均為去離子水。

1.2 儀器與設備

ZNCL-GS電熱恒溫水浴 鄭州市亞榮儀器有限公司；BSA2245-CW精密電子天平 德國Sartorius公司；Ultra-Turrax T10高速剪切機 德國IKA公司；HAKKE RS600流變儀 德國Thermo公司；TCS SP5激光掃描共聚焦電子顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM） 德國Leica公司；JEM-2100F透射電鏡（transmission electron microscope，TEM） 日本電子株式會社；Axioskop 40 Pol/40A Pol偏光顯微鏡（polarized light microscope，PLM）、Merlin高分辨場發射掃描電子顯微鏡（field emission scanning electron microscope，FE-SEM） 德國Zeiss公司；Mastersizer 3000微米粒度儀 英國Malvern公司。

1.3 方法

1.3.1 GA纖維乳液凝膠的制備

參考Wan Zhili等[10]的方法并稍作修改。稱取一定量的GA粉末溶入純水中，使用恒溫水浴鍋在80 ℃水浴加熱、400 r/min攪拌5 min；得到澄清溶液后，再將適量油相分散到GA纖維溶液中；然后將所得混合液水浴加熱（溫度80 ℃、時間2.5 min），之后用Ultra-Turrax T10高速剪切機均質混合液，15 000 r/min均質2 min；最后，冷卻樣品獲得精油乳液凝膠。

1.3.2 乳液粒度測定

精油乳液凝膠復原后乳液粒度和大小分布利用Mastersizer 3000粒度儀測定。樣品處理：20 倍純水稀釋，室溫（25 ℃）緩慢攪拌。樣品折射率設置為1.456，吸收率為0.001；泵速為2 400 r/min。所有測試均在25 ℃完成，數據為3～7 次重復的平均值。

1.3.3 乳液凝膠微觀結構表征[9]

1.3.3.1 PLM法

取少量樣品于平板載玻片上并置于載物臺。在普通光源下確定樣品后，切換至偏光采集圖像，放大倍數為500（50h 10）。

1.3.3.2 CLSM法

GA纖維精油乳液凝膠的微觀結構用TCS SP5 CLSM觀察。用蓋玻片壓緊置于單凹載玻片中的樣品，再將樣品固定在顯微鏡載物臺上，用100 倍油鏡觀察樣品。0.1%質量分數尼羅紅標記的樣品用488 nm的氬離子激光激發，圖中被染色的是油相，顏色為紅色。0.01%質量分數ThT標記的樣品選擇458 nm氬激光激發，圖中被染色的是GA纖維網絡，顏色為藍色。樣品在掃描密度512h 512、掃描頻率400 Hz下觀察并確定后，在掃描密度1 024h 1 024、掃描頻率100 Hz采集圖像，最后用LAS AF Lite軟件進行分析和處理。

1.3.3.3 FE-SEM法

測試所用乳液凝膠的油相用正己烷替代，水浴加熱溫度70 ℃，均質時間1 min；其他條件與1.3.1節相同。制備的樣品在常溫（25 ℃）常壓下風干一夜后，用導電膠將沾有所得干燥樣品的云母片固定在金屬載臺，并在樣品表面噴上一層黃金粉，最后用FE-SEM觀察乳液凝膠的網絡結構。

1.3.4 流變學測定

參考Wan Zhili等[10]的方法并稍作修改。乳液凝膠的流變特性用配備平板（直徑35 mm，間隙1.0 mm）的哈克流變儀測定。應力掃描（頻率固定為1 Hz、應力變化范圍0.1～1 000 Pa）和頻率掃描（應力選定處于線性黏彈區為1 Pa、頻率變化范圍0.1～100 Hz）。所有的實驗均在25 ℃進行。

1.4 數據分析

利用SPSS 11.7和Origin 9.0軟件進行數據統計分析及作圖，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 GA纖維茶樹精油乳液凝膠的制備

圖1 GA纖維（0.1%）的TEM（A）及不同冷卻方式制備的纖維乳液凝膠（4% GA纖維、40%茶樹精油）外觀圖（B）Fig.1 TEM images of 0.1% GA nanofibril solution (A) and photographs of emulsion gels (containing 4% GA fibrils and 40% TTO)made using different cooling procedures (B)

已有研究表明，天然手性皂苷GA分子可以在水中自組裝形成厚度大約為2.5 nm的長纖維[8]。如圖1A所示，通過透射電鏡可以觀察到，在0.1% GA纖維溶液中，幾乎所有的GA分子自組裝形成了均一的長納米纖維；這與Saha等[8]的研究結果一致。GA纖維具有兩親性，能有效降低油水界面張力，并能夠形成多層界面網絡以穩定油滴[5]。如圖1B所示，茶樹精油乳液凝膠樣品油相質量分數和GA質量分數分別固定為40%、4%，冷卻條件分為室溫和冰浴冷卻。可以明顯看出，室溫冷卻獲得的樣品出現了分層，上層是乳液凝膠，下層是GA超分子水凝膠；而通過冰浴冷卻得到的乳液凝膠沒有分層出現。這表明冰浴冷卻可以促進膠凝的形成，通過快速冷卻可以加快連續相及油滴表面GA纖維網絡的形成，并讓乳滴在凝膠內部均勻分散[9,24]。

2.2 GA纖維質量分數對茶樹精油乳液凝膠的影響

圖2 不同GA纖維質量分數下的乳液凝膠外觀（A）、應力掃描（B）、頻率掃描（C）和CLSM（D）圖Fig.2 Photographs (A), amplitude sweeps (B), frequency sweeps (C) and CLSM images (D) of emulsion gels made with different GA nanofibril concentrations

快速冷卻條件能促進茶樹精油乳液凝膠的形成，為了更好地制備出GA纖維穩定的茶樹精油乳液凝膠，首先探究GA纖維質量分數對茶樹精油乳液凝膠的影響。如圖2所示，所有的乳液凝膠樣品油相質量分數固定為40%，GA纖維質量分數范圍為0.5%～4%，冷卻條件為快速冰浴。前期研究表明，GA纖維質量分數高于0.3%時，GA纖維可以在水中纏繞形成纖維三維網絡，最終形成超分子水凝膠[6,8]。如圖2A所示，0.5% GA纖維精油乳液凝膠呈乳液狀，不能實現凝膠化，并出現分層；當體系中添加的GA纖維質量分數從1%逐漸增加至4%時，樣品凝膠化程度逐漸增加，這可能是因為GA纖維質量分數增加，體相中的GA纖維網絡更加緊密。這說明通過一步高溫乳化結合快速冷卻工藝和調控GA纖維質量分數可以得到GA纖維穩定的精油乳液凝膠，可以推斷GA纖維質量分數對茶樹精油乳液凝膠的形成具有決定性作用。

通過測定樣品的流變學行為，可以了解其微觀結構和機械性質。因此，這里利用小幅振蕩剪切流變探究GA纖維質量分數對精油乳液凝膠振蕩性質的影響。通過振蕩測試（應力和頻率掃描）實驗，可以獲取乳液凝膠的儲存模量（G’）、損耗模量（G”）、屈服應力值（G’=G”處）、線性黏彈區等參數。G’可以反映乳液網絡結構的彈性行為，G”可以反映乳液網絡結構的黏性行為。從圖2B可以看到，在線性黏彈區內2%和4% GA纖維乳液凝膠的G’均明顯高于G”，說明樣品都表現出類彈性固體性質。隨著應力進一步提高，G’和G”顯著下降，當超過應變的臨界值（交點）后網絡結構將被破壞[25]。對于結構流體，屈服應力值越高代表材料越穩定[26]。圖2B表示，4%的GA纖維乳液凝膠的黏彈性（G’和G”）及穩定性均高于2%的GA纖維乳液凝膠。另外，圖2B應力掃描的測試結果也確定了在1 Pa應力以及1 Hz頻率下，所有的樣品的G’和G??都在線性黏彈區內。因此，進一步測試樣品在恒定的1 Pa應力、0.1 Hz上升至100 Hz頻率下黏彈性的變化。由圖2C可知，所有樣品的G’和G”在0.1～100 Hz內均表現出較弱的頻率依賴性，說明此時的乳液凝膠的振蕩性質受所施加應力的影響較小，均顯示出較好的黏彈性網絡結構。圖2A～C共同說明了高質量分數GA纖維穩定的精油乳液凝膠具有較高的凝膠強度，GA纖維質量分數可以顯著影響茶樹精油乳液凝膠的機械特性。

乳液凝膠的微觀結構與其流變特性相關，因此利用CLSM觀察和分析茶樹精油乳液凝膠的結構。從圖2D尼羅紅染油（圖中顯示為紅色）可以看到，隨著GA纖維質量分數的提高，乳液凝膠中油滴粒度逐漸減小，油滴間堆積也變得更緊密。GA纖維質量分數的增加表示GA纖維數量的增多，導致油水界面張力的降低，乳滴粒度變小[6]。

2.3 茶樹精油質量分數對茶樹精油乳液凝膠的影響

圖3 不同茶樹精油質量分數下的乳液凝膠外觀（A）、應力掃描（B）和頻率掃描（C）圖Fig.3 Photographs (A), amplitude sweeps (B) and frequency sweeps (C) of emulsion gels made with different TTO concentrations

GA纖維質量分數的增加可明顯影響茶樹精油乳液凝膠強度及乳液粒度。有研究表明，乳液凝膠的結構性質與凝膠基質的類型、油含量及類型、油滴與基質的作用等因素有關[27-29]。因此本實驗進一步研究茶樹精油質量分數對乳液凝膠的影響。如圖3所示，乳液凝膠樣品GA纖維質量分數固定為4%，油相質量分數范圍為10%～40%，樣品冷卻條件為冰浴。由圖3A可知，隨著茶樹精油質量分數的增加，乳液凝膠的外觀變得更加干燥。此外，茶樹精油乳液凝膠均具有較好的延展性，且易涂抹，具備在食品、藥品、化妝品等行業應用的潛力。

Vliet[30]指出，活性填充顆粒的油滴越多，油滴之間的堆積作用增強，其黏彈性增加越明顯。從圖3B可看出，茶樹精油乳液凝膠樣品的線性黏彈區、屈服應力值和G’和G”均隨著油相質量分數增加而增加。如圖3C所示，樣品均在0.1～100 Hz范圍內表現出較低的頻率依賴性。結合圖3、4結果，說明GA纖維穩定的精油乳液凝膠的凝膠強度相當高，特別是高GA纖維質量分數、高油相質量分數的乳液凝膠，其歸因于油滴之間的堆積作用及GA纖維網絡形成。

2.4 混合油比例（葵花籽油/MCT）對乳液凝膠的影響

2.4.1 混合油相下制備的乳液凝膠粒度及流變特性

利用GA納米纖維制備的精油乳液凝膠具有高凝膠強度、可涂抹性。隨著GA纖維和茶樹精油質量分數的增加，乳液凝膠的結構性質增強，但其外觀的粗糙程度并未隨之改善。葵花籽油含有大量的亞油酸，為長鏈脂肪酸甘油三酯。MCT是一種飽和脂肪酸，其氧化穩定性較好。因此將體系中油相固定為40%，GA纖維質量分數固定為4%，進一步探究MCT/葵花籽油在油相中的比例變化對乳液凝膠的影響。

圖4 不同混合油比例下的乳液凝膠外觀圖（A）、復合乳液粒度分布圖（B和C）Fig.4 Photographs (A) of emulsion gels and droplet size distributions(B and C) with different oil phase compositions

如圖4A所示，隨著葵花籽油和MCT在精油油相中比例的增加，乳液凝膠的外觀變得更加細膩、均勻，涂抹性提高。從圖4B、C可以看到，油滴的粒度明顯受油相組成的影響，葵花籽油和MCT的增加能夠讓茶樹精油乳液粒度的分布變得更窄，并從雙峰曲線變成單峰曲線。與此同時，隨著葵花籽油和MCT在油相中比例的增加，乳液的粒度分布整體右移且逐漸均勻，這說明油相組成的改變可以顯著影響乳液凝膠油滴的分布和尺度。乳液的平均液滴尺寸依賴于風味油類型和質量分數[31]，由圖4可以推斷油滴的粒度與GA纖維乳液凝膠的油相組成密切相關。

為了更好地研究油相組成對乳液凝膠的影響，同樣對這些乳液凝膠進行流變學測試。從圖5A、B的應力掃描圖及圖5C、D的乳液凝膠頻率掃描圖可以看到，在線性黏彈區內所有樣品的G’均明顯高于G”，說明這些由不同油相比例組成的GA纖維乳液凝膠均具有類彈性固體性質。所有樣品均表現出相對較低的頻率依賴性。當油相為單獨的茶樹精油時，乳液凝膠具有最低的G’和G”；隨著混合油中茶樹精油比例的降低，乳液凝膠具有更寬的線性黏彈區、更高的臨界應力（G’和G”交點處）以及較高的G’和G”值。以上結果表明茶樹精油乳液凝膠體系可以通過改變油相組成如添加葵花籽油或MCT調控其機械性質。

圖5 不同混合油比例下的乳液凝膠的應力掃描圖（A和B）和頻率掃描圖（C和D）Fig.5 Amplitude sweeps (A and B) and frequency sweeps (C and D) of emulsion gel with different oil phase compositions

2.4.2 混合油相乳液凝膠的微觀結構

Wan Zhili等[9]研究表明，由于形成各向異性的GA纖維網絡，由GA纖維穩定的乳滴或泡沫結構可以在偏光下表現出強烈的雙折射現象。因此本實驗利用PLM觀察GA纖維及纖維網絡的分布。從圖6可以看到，油滴表面的GA纖維顯示出馬耳他十字光環，說明GA纖維在乳滴表面形成了各向異性的纖維結構膜。所有的樣品都具有蜂窩狀網絡結構，并在PLM下表現出雙折射現象，特別是葵花籽油和MCT樣品；此外可以看到隨著茶樹精油比例的增大，網孔和油滴粒度越小，這可能歸因于茶樹精油極低的表面張力[9]。

圖7 不同混合油比例下的乳液凝膠的CLSM圖Fig.7 CLSM images of emulsion gels with different oil phase compositions

進一步采用CLSM觀察不同油相組成的GA纖維乳液凝膠的微觀結構。由圖7A可以看到，茶樹精油在混合油相中的比例越高，乳液凝膠中油滴堆積越緊密。由圖7B可以看出，均連續的GA纖維網絡結構，凝膠網絡中油滴的粒度也與PLM圖（圖6）以及粒度分布圖（圖4B、C）一致，隨著MCT/葵花籽油在油相中比例的增加，GA纖維網絡片狀的聚集（圖中深色區域）逐漸減少，說明MCT/葵花籽油的添加能減少茶樹精油乳滴絮凝的產生，這可能是因為MCT/葵花籽油的添加有效抑制了液滴生長，改善體系的穩定性（如抑制乳滴絮凝、奧斯特瓦爾德熟化現象等）[32]。結合乳液粒度特征圖和外觀結果（圖4），可以確定油相組成可以顯著影響油滴的粒度及粒度分布，最終影響GA纖維乳液凝膠的微觀結構。

圖8 GA纖維（4%）穩定的以正己烷為油相（40%）的乳液凝膠干燥樣品的FE-SEM圖Fig.8 FE-SEM images of emulsion gels with 4% GA nanofibrils and 40% hexane oil phase

已有研究顯示，正己烷不會影響GA纖維乳液凝膠的形成[6]。從圖8可以看出，類“蜂巢”結構的多孔（多面體孔形）連續網絡，在纖維網絡中油滴緊密堆積，與之前的PLM（圖6）和CLSM（圖7）結果一致。另外，在油滴外部覆蓋著一層較平滑致密的GA纖維網絡結構，可能是由水相中的GA纖維間相互糾連，并與油滴表面的GA纖維相互作用而形成。FE-SEM結果增加了對GA纖維乳液凝膠的微觀結構和機械性質的認識。

3 結 論

利用天然皂苷GA納米纖維的兩親性和凝膠性，在GA纖維質量分數大于0.5%下，通過高速剪切作用使GA纖維吸附在油-水界面制得O/W型乳液，隨后通過快速冷卻促進GA纖維三維網絡的形成，從而制備出具有良好可塑性和涂抹性的茶樹精油乳液凝膠。GA纖維茶樹精油乳液凝膠的性質可通過改變GA纖維質量分數、油含量和油相組成進行調控。隨著GA纖維質量分數與油相含量的提高，乳液凝膠表現出更強的流變特征，包括更寬的線性黏彈區、更高的臨界應力（G’和G”的交點）以及更高的G’值。通過將葵花籽油和MCT兩種常用油與茶樹精油進行復配，能顯著影響茶樹精油乳液凝膠粒度、流變特性以及微觀結構，可使茶樹精油乳液凝膠粒度分布更為均勻，并具備更高的凝膠強度。天然植物精油結構化材料在化妝品、食品、醫藥等領域具備良好的應用潛力。