曲霉型豆豉發酵階段細菌群落的演替及其與環境因子的關系

趙文鵬，李 浩，楊慧林，王筱蘭

（江西師范大學生命科學學院，江西 南昌 330022）

豆豉作為一種我國特有的傳統發酵調味品，通過微生物發酵，較好地保留了大豆原有的營養，也衍生出一定的藥用價值，并賦予豆豉獨特的風味[1]。豆豉大體可分為霉菌型及細菌型兩類，其中霉菌型豆豉的發酵過程分為制曲及（后）發酵兩階段，依據制曲過程的優勢微生物劃為毛霉型、曲霉型和根霉型[2]。我國南方常見的曲霉型豆豉的傳統發酵工藝往往以開放式制曲及長時間后發酵為主要特點，整體上屬于半開放式發酵過程，由此造成在不同地域環境下即使采用同樣的原料及工藝，豆豉微生物群落結構也不完全相同，進一步體現為豆豉風味及營養的差異。顯然，若在明確豆豉發酵中核心微生物群的同時，能將理化因子對核心微生物的影響予以量化，將更有助于理解豆豉發酵過程微生物的演替規律，也可為豆豉品質的定向調控提供一定的理論支撐。

近年來測序技術快速發展，以16S rRNA高通量測序[3]和宏基因組測序[4]為代表的研究策略已較為成熟，其在發酵食品領域主要用于分析發酵食品生產過程中微生物菌群結構動態變化規律以及核心功能微生物[5-6]，如白酒[7-8]、泡菜[9-10]、豆豉[11-12]、食醋[13-14]和醬油[15]等。以往豆豉中的微生物多樣性研究主要關注不同產地豆豉微生物結構差異的比較，少數研究則闡明了同種豆豉不同階段微生物多樣性的演替，如石聰等[16]利用454測序技術對瀏陽豆豉3階段的真菌及細菌分布特點進行了報道，本實驗室也利用Illumina MiSeq平臺對曲霉型豆豉9 個階段的微生物菌群演替進行了探究，發現相較于制曲階段的微生物多樣性單一，發酵階段細菌多樣性變化顯著[12]。不難發現，目前曲霉型豆豉的研究熱點在于利用高通量測序技術挖掘與豆豉品質密切相關微生物資源，解析發酵過程中曲霉型豆豉微生物群落動態變化，但針對發酵理化因子與曲霉型豆豉微生物群落演變關聯性研究鮮有報道，與此同時，已有研究者依托高通量測序技術對某些發酵食品微生物群落演變的關聯性進行了報道[17]。

為此，本研究通過采集發酵階段不同時期的曲霉型豆豉，基于高通量測序技術對豆豉不同發酵階段的細菌群落組成和變化趨勢進行系統比較，并結合發酵環境的理化因子進行相關性分析，以闡明發酵環境與豆豉發酵階段細菌群落演替的內在聯系，從而為后續優化曲霉型豆豉的發酵工藝提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

曲霉型豆豉于南昌稻香園調味食品有限公司采集。以黑豆為原料蒸煮1 h后，其工藝主要包括室溫制曲（米曲霉滬釀3.042，接種量0.001 5%（質量分數））7 d、人工控溫發酵（堆積自然接種1 d，拌6%（質量分數）鹽于發酵池發酵）3～4 周兩個過程，中間含洗曲步驟。本研究樣品均為洗曲后不同發酵階段的豆豉。采樣時，于發酵池3 個區域分層取樣，同一區域樣品充分混合后裝入已滅菌的自封袋，并做好標記。分別在發酵第0、1、5、9、13、19天取樣（編號：Day0、Day1、Day5、Day9、Day13、Day19），每個發酵階段含3 個樣品，樣品采集完畢保存于冰盒并立即帶回實驗室后，部分存于-80 ℃冰箱備用。

Soil DNA Kit與Gel Extraction Kit 美國Omega公司；其他常規生化試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；MiSeq測序儀美國Illumina公司；NanoDrop ND-2000超微量分光光度計美國Thermo Scientific公司；臺式高速離心機 生工生物工程（上海）股份有限公司；電泳儀 北京市六一儀器廠；pH計 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 理化因子測定

1.3.1.1 溫度測定

將溫度計置于發酵池內部測量，待溫度穩定后讀數，多次測量發酵池的溫度，結果以平均值表示。

1.3.1.2 含水量測定

采用常壓恒重干燥法測定豆豉水分含量。取多個干凈鋁制稱量瓶，放入電熱恒溫鼓風干燥箱中，于100 ℃干燥1 h后取出冷卻后稱量，重復此操作至前后兩次稱量的差值不超過2 mg為質量恒定。稱取剛取回的豆豉樣品，放入質量恒定的鋁制瓶中，稱質量并記錄，于100 ℃加熱干燥2 h，冷卻后取出稱量，重復稱量至質量恒定。結果以平均值表示，實驗重復3 次。設質量恒定稱量瓶的質量為M1，樣品與質量恒定稱量瓶的質量為M2，干燥質量恒定的樣品與稱量瓶的質量為M3，含水量按下式計算：

1.3.1.3 pH值測定

取3 份50 mL蒸餾水，用pH儀測定其pH值，調整測定差值不超過0.02，此為空白對照組。取豆豉樣品各2.0 g左右，破碎后加入空白組蒸餾水，攪拌均勻（30 min），靜置測定豆豉懸浮液的pH值。實驗重復3 次。

1.3.1.4 總酸含量測定

采用NaOH滴定法。稱取冷凍干燥豆豉樣品各2.5 g，粉碎后放入100 mL燒杯中，加入純水充分攪拌30 min，定容到100 mL。取懸浮液于10 000 r/min離心10 min，收集上清液；吸取20 mL上清液，置于100 mL干凈三角瓶中，滴加2 滴酚酞試劑，開動磁力攪拌器，用NaOH標準溶液滴定至酚酞變色，并在30 s內不變色時停止。記錄標準溶液的消耗體積，計算總酸含量。

1.3.1.5 總醇含量測定

稱取冷藏的豆豉樣品100.0 g，研碎后加入純水充分攪拌30 min，后定容到50 mL，取懸浮液10 mL于10 000 r/min離心10 min，收集上清液；取上清液1 mL于試管中，加入2 mL重鉻酸鉀溶液，再加純水至10 mL，混合均勻后沸水浴10 min，取出冷卻至室溫；于610 nm波長處測定吸光度，計算總醇含量。乙醇標準曲線的制作參考文獻[18]。

1.3.1.6 還原糖含量測定

稱取冷藏豆豉樣品各10.0 g左右，研碎后加入純水充分攪拌30 min，后定容至100 mL，取懸浮液10 mL于10 000 r/min離心10 min，收集上清液；取上清液1 mL置于25 mL試管中，補水至2 mL，加1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸溶液，搖勻后于沸水浴加熱5 min，取出冷卻至室溫，用純水稀釋至25 mL，于540 nm波長處測定吸光度，計算還原糖含量。葡萄糖標準曲線的制作參考相關文獻[19]。

1.3.2 豆豉樣品宏基因的提取及PCR擴增

稱取豆豉樣品各1.00 g，用pH 7.0磷酸鹽緩沖液將豆豉振蕩洗滌3 次，將洗脫液用雙層紗布（已滅菌）過濾。將濾液于4 ℃離心后棄上清液，完成豆豉中微生物的收集。按照提取試劑盒說明書操作，完成豆豉微生物宏基因的提取。提取完畢，利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳及超微量分光光度計評估宏基因的完整性、濃度及污染程度。

將檢測合格的宏基因樣品作為底物，采用添加標簽的338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）及806R（5’-GACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物對細菌16S rRNA的V3-V4保守區域進行擴增，PCR擴增的具體參數參考相關文獻[12]。將PCR擴增產物切膠回收，利用超微量分光光度計統一各樣品的DNA總量，最后將處理好的DNA樣品送至天津諾禾致源生物信息科技有限公司Illumina MiSeq平臺進行測序。

1.3.3 高通量測序數據的分析處理

經原始數據進行拼接（FLASH，version 1.2.11），質量過濾（Trimmomatic，version 0.33），去除嵌合體（UCHIME，version 8.1），得到高質量的Tags序列。Trimmomatic軟件質控，使用FLASH軟件進行拼接，然后用Usearch（vsesion 7.0）軟件和 UCHIME 軟件過濾，剔除嵌合體得到Effective tags，根據97%的相似度對序列進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類。在相似性97%的水平上對序列進行聚類（USEARCH，version10.0），以測序所有序列數的0.005%作為閾值過濾OTU。序列經由RDP Classifier置信度閾值為0.8（version 2.2 Silva數據庫）進行比對后物種分類注釋，比較分析樣品中微生物群落結構及組成[20]。利用MOTHUR軟件計算Chao 1和Shannon指數。使用R軟件（Version 2.15.3）繪制UPGMA聚類樹。采用CANOCO 4.5軟件對細菌群落結構差異性進行主成分分析（principal component analysis，PCA），細菌群落與理化因子間的相互關系進行冗余分析（redundancy analysis，RDA）。

1.4 數據提交

本研究涉及的高通量測序的原始序列信息已提交至NCBI（National Center for Biotechnology Information）網站SRA（Sequence Read Archive）數據庫。項目檢索號：SRP219928；18 個樣品檢索號：SRR10046494～SRR10046511。

2 結果與分析

2.1 曲霉型豆豉宏基因提取

圖1 不同發酵時間曲霉型豆豉的宏基因瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of bacterial metagenomics DNA from Aspergillus-type Douchi at various fermentation stages

經瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，各發酵階段的宏基因主條帶大小在15 kb左右（圖1）。其中，發酵第0天、第1天的宏基因組條帶完整性較好且明亮，說明此時微生物豐度相對較高；發酵第5天基因組條帶亮度驟降，在發酵第9～19天時，基因組條帶亮度繼續下降至幾乎消失，且拖尾嚴重。由此反映曲霉型豆豉發酵是微生物量減少的過程。

2.2 曲霉型豆豉理化因子演替規律

總醇、水分、總酸、還原糖含量和溫度是曲霉型豆豉發酵過程中的重要理化因子，發酵過程整體上可劃分為3 個階段：發酵前期（Day0與Day1）、發酵中期（Day5與Day9）和發酵后期（Day13與Day19）。發酵過程中主要理化因子變化程度普遍較大（表1），其中總醇含量由0.99 mg/g緩慢下降至0.78 mg/g；還原糖含量則是由30.10 mg/g下降至12.90 mg/g；總酸含量由5.75 mg/g上升至16.75 mg/g；含水量則由45.59%下降至36.15%；相應的pH值由5.52下降至4.49最終穩定在5.12；溫度波動較大，具體表現為中期最高，其中Day5是發酵過程中的最高溫度（45.6 ℃）。總體上豆豉的水分、總醇含量、pH值和還原糖含量呈下降趨勢，總酸含量一直上升，溫度則是先升后降的趨勢。

表1 曲霉型豆豉發酵過程中豆豉理化因子變化Table 1 Variations in physicochemical properties duringAspergillus-type Douchi fermentation

2.3 曲霉型豆豉細菌α多樣性

圖2 曲霉型豆豉發酵過程中細菌群落α多樣性變化Fig.2 Variation in alpha diversity of bacterial communities duringAspergillus-type Douchi fermentation

Chao 1指數和Shannon指數分別體現微生物群落的物種多樣性和物種分布的均勻度。具體來看，豆豉細菌群落的Chao 1指數由93.27下降到70.82，又上升至95.65隨后下降至59.07，最終穩定在90.25；Shannon指數則由1.79上升到2.44，又下降至1.23，最終穩定在2.30（圖2）。這說明在豆豉發酵過程中細菌群落的多樣性不斷降低；均勻度總體提高。Day0與Day1相比，發酵前期豆豉細菌群落的Chao 1指數無顯著差異（P＞0.05），Shannon指數具有顯著差異（P＜0.05）；Day5與Day9相比，發酵中期的Chao 1指數具有顯著差異（P＜0.05），Shannon指數具有極顯著差異（P＜0.01）；Day13與Day19相比，發酵后期的Chao 1指數與Shannon指數均具有極顯著差異（P＜0.01）。說明曲霉型豆豉發酵過程中細菌群落組成發生了顯著變化。

2.4 曲霉型豆豉細菌群落組成

2.4.1 門水平上細菌群落組成

圖3 曲霉型豆豉發酵過程中細菌群落的相對豐度分布Fig.3 The distribution of bacterial community during Aspergillus-type Douchi fermentation

經分類學注釋，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）是豆豉發酵的主要優勢門（圖3a，平均相對豐度＞1%），三者平均相對豐度分別為81.15%、10.70%和7.17%，其他菌門僅占0.45%。就各優勢門的變化趨勢看，厚壁菌門與放線菌門的相對豐度在發酵前13 d變化均不大，其中厚壁菌門作為突出優勢門，在發酵前13 d的相對豐度均超過70%，但在Day19迅速下降至54.08%；放線菌門也于Day19由起始10.97%下降至2.67%，與Day19新晉優勢門即擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度（2.73%）基本相當。對于變形菌門而言，其在前13 d的相對豐度維持在1.57%～9.95%之間，但其在Day19的相對豐度迅速上升至39.85%，這與另兩個優勢門的變化趨勢相反。總體來看，厚壁菌門和放線菌門相對豐度呈下降的趨勢，變形菌門相對豐度卻是上升的趨勢。

2.4.2 屬水平上細菌群落組成

基于屬水平上的分類學注釋結果表明，豆豉發酵中主要菌屬數為1 0 個（圖3 b，平均相對豐度＞1%）。在Day1、Day5及Day9，單一或兩大優勢屬相對豐度均超過80%，而在其他階段，菌屬的分布則往往更為均衡、多樣。而從特定屬在各發酵階段的分布看，各優勢屬的豐度變化趨勢復雜。發酵前期，葡萄球菌屬（Staphylococcus）呈上升趨勢，相對豐度為67.57%～85.97%，是該時期豆豉細菌群落相對豐度最高的菌屬。此外該時期還存在芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterbacter）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）和擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）等。發酵中期溫度升高后，葡萄球菌屬的相對豐度大幅度降低（24.16%）；而就一些典型的乳酸細菌屬看，如乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和片球菌屬（Pediococcus）等，其在Day5的相對豐度分別達到21.60%、21.74%和13.50%，但在其他時期，三者僅在1%左右甚至更少。隨著發酵后期的到來，葡萄球菌屬（42.67%）和腸桿菌屬（19.53%）重新成為豆豉細菌群落的優勢微生物。另外，包括棒狀桿菌屬、擬諾卡氏菌屬等放線菌在各發酵階段的相對豐度也均有較大的變化。

2.5 曲霉型豆豉細菌群落分布特征

圖4 曲霉型豆豉細發酵過程中細菌群落結構UPGMA聚類分析（a）和PCA（b）Fig.4 UPGMA cluster analysis (a) and principal component analysis (b) of bacterial community structure during Aspergillus-type Douchi fermentation

通過UPGMA聚類（圖4a），發現豆豉發酵前期與后期細菌群落結構的遺傳距離較短，且在相鄰兩階段表現尤為明顯；而發酵中期豆豉細菌群落結構的遺傳距離遠大于前兩者。由此說明發酵中期的豆豉細菌群落結構與前后期相比存在較大差異，發酵前期與后期的細菌群落結構更為相似。

由圖4b可知，PC1與P C2兩軸的累計解釋率達97.57%，其中PC1軸（59.78%）整體上能夠較好區分開豆豉發酵過程中的細菌群落，且組內樣品的重復性較好。發酵各個時期細菌的菌群結構均存在一定差異。發酵前、中期（Day0～Day9），不同時間段豆豉樣品分布較為分散，表明處于前中期細菌菌群結構差異較大，特別是中期細菌菌群結構存在較大差異。而從發酵后期（Day13～Day19）看，該時期樣品的聚集度很高，表明在后期豆豉菌群結構極其相似。

2.6 曲霉型豆豉細菌群落與理化因子關聯分析

圖5 豆豉理化因子與細菌優勢屬的RDAFig.5 Redundancy analysis of physicochemical factors and dominant bacterial genera

理化因子關聯分析后發現，二維排序軸RDA1和RDA2解釋種群與環境的累計變化率分別為37.89%和25.22%，兩軸和為63.11%（圖5），說明RDA1和RDA2即較好地反映出豆豉細菌群落與發酵環境之間的內在關聯。就主要優勢屬看，葡萄球菌屬和芽孢桿菌屬與pH值、水分、還原糖和總醇含量箭頭方向基本一致，說明這兩個屬與pH值、水分、還原糖和總醇含量存在正相關，并以芽孢桿菌屬表現尤為顯著；而棒狀桿菌屬、乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和片球菌屬與溫度、pH值、水分、總醇和還原糖箭頭方向基本一致，且與溫度呈明顯正相關并以棒狀桿菌屬尤為強烈；腸桿菌屬則與總酸含量箭頭方向一致，兩者存在顯著正相關。

從樣品細菌群落分布看，前期豆豉細菌群落的分布主要受水分、還原糖、總醇以及pH值的影響，中后期則是總酸和溫度推動發酵進程。表明豆豉發酵細菌結構的演替與發酵環境密切相關。此外，依據優勢菌屬與理化因子相關性具體排序結果（表2），對豆豉發酵優勢屬具有重要影響的理化因子指標包括還原糖含量（r2=0.263，P＜0.01）、溫度（r2=0.248，P＜0.01）和pH值（r2=0.203，P＜0.01），說明還原糖含量、溫度和pH值可能是豆豉發酵過程中細菌群落演替的主要驅動因子。

表2 豆豉理化因子與細菌優勢屬的蒙特·卡羅檢驗Table 2 Monte Carlo permutation test of physicochemical factors and dominant bacterial genera

3 討 論

傳統曲霉型豆豉在不同的地域和環境下因工藝不同，豆豉微生物的群落演替各異。研究人員通過對許多豆制品發酵過程中的微生物進行可培養實驗和高通量測序，普遍發現細菌是其發酵過程的主要參與者[21-23]。為此，本研究將焦點放在探索豆豉發酵中細菌結構變化及其與發酵環境間的內在關聯。首先，從豆豉中微生物的總量看，發酵前期宏基因濃度遠大于中后期，且呈現下降趨勢，表明豆豉發酵總體上是微生物不斷衰亡的過程，此時豆豉中各類微生物雖在逆境（高滲、高溫、低pH值等）耐受上存在差異，但在較大的環境脅迫壓力下，各類微生物在豆豉發酵的中后期，普遍歷經消亡、休眠或緩慢增殖的過程，這一點從豐富度指數整體呈下降的趨勢也得到了側面印證。

其次，從細菌群體的相對分布規律看，厚壁菌門是曲霉型豆豉發酵的優勢類群，這與之前許多研究報道均較為類似[11,24-25]；隸屬于該門的葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、片球菌屬和魏斯氏菌屬等因對發酵環境具有較好的抗逆性，在發酵食品較為常見[26]，這可能是促使厚壁菌門持續成為豆豉發酵中優勢類群的重要原因。具體到各屬，整個發酵過程雖然細菌群落結構不斷變化，尤其是發酵中期細菌菌群演替尤為劇烈，群落分布也極其不均勻，但葡萄球菌屬始終是作為發酵菌屬的核心角色，芽孢桿菌屬及棒狀桿菌屬占比也較高，三者對某些逆境（鹽濃度、氧濃度等）耐受閾值較其他許多發酵細菌更高，優勢菌屬以絕對的豐度優勢消耗發酵環境中的營養基質，間接占據了諸多其他菌屬的生存空間。由此細菌群落可能經過環境壓力選擇趨于同化，這也是細菌群落的“自我凈化”[27]，使得中期過渡到后期的過程中豆豉細菌群落結構趨向于穩定。

另一方面，發酵食品作為一類人為創設的生境，其自身的溫度、酸堿性、有機碳和水分在很大程度上影響發酵食品微生物的生存、演替。有研究發現乙醇、還原糖、pH值和溫度等是大曲、白酒及黃酒發酵中菌群演替的主要驅動力[17,28-29]。而在本研究中，曲霉型豆豉發酵在很大程度上是人為升溫、保溫、最終降溫的過程，這種溫度變化主要是人為控制因素，另外一定程度上也受細菌產熱和豆豉堆積的影響[30]。發酵前期適宜發酵溫度和pH值能夠為細菌增殖提供良好的生存條件。豐富的碳源及適宜的pH值使得以葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬為代表的優勢屬增殖，諸類優勢屬在發酵前期微生物總量較多，代謝中較多地分泌了促進大分子營養基質分解的各類酶類（如淀粉酶、蛋白酶等），發酵初期歷經高滲（拌鹽）、低氧（密閉）等環境的限制，營養因素（如還原糖）可能也是抑制發酵菌屬快速增殖的重要原因。伴隨發酵中期溫度的驟升，葡萄球菌和芽孢桿菌屬的增殖受限。值得注意的是，此時某些放線菌如棒狀桿菌屬的相對豐度卻更高，而該菌屬在白酒發酵、醇類生產等高溫發酵的報道中較為常見[17]，側面說明棒狀桿菌耐高溫脅迫能力相對更高。此外，相對更高的溫度及前期其他菌屬的代謝物，一定程度上使乳酸桿菌屬、片球菌屬和魏斯氏菌屬等乳酸菌更具優勢[31]，乳酸菌適應環境同時活躍代謝產酸使得發酵環境pH值繼續下降，而愈加酸化的環境則可能會抑制以乳桿菌屬[32]、魏斯氏菌屬[33]為代表的乳酸菌自身生長。但在發酵后期，隨著溫度的緩慢下降，增殖速度較快的葡萄球菌屬、腸桿菌屬、芽孢桿菌屬在解除了顯著負相關的環境因子即高溫的限制，重新成為優勢菌屬，并且出現其他菌屬如慢生桿菌屬形成新的生態平衡。總體上看，高溫、有機酸的累積、還原糖消耗以及菌屬競爭降低豆豉細菌類群的豐富度，卻一定程度促進群落多樣性和推動發酵。豆豉發酵的許多菌屬，葡萄球菌屬、乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和片球菌屬等對發酵溫度、pH值以及還原糖的變化較為敏感。因此，未來通過科學、精確地控制豆豉發酵過程中的環境因素，對不同批次豆豉保持穩定的品質風味具有重要的生產意義。

4 結 論

曲霉型豆豉在發酵過程中，伴隨著發酵環境的變化，微生物總量逐步減少，隸屬于厚壁菌門的葡萄球菌屬、乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和片球菌屬在發酵進程中十分重要，雖然細菌菌落結構波動較大，但葡萄球菌屬始終為核心，而還原糖、pH值以及溫度可能是造成豆豉細菌群落演替的重要驅動因子。考慮到實際生產需要，溫度可能是未來豆豉工業化生產的人為控制的重要因素。