黃桿菌褐藻膠裂解酶的高效表達及其在褐藻寡糖制備中的應(yīng)用

江 君，劉 軍，楊紹青，馬 帥，閆巧娟，江正強,*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，中國輕工業(yè)食品生物工程重點實驗室，北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083）

褐藻膠裂解酶作為一種多糖裂解酶（polysaccharide lyase，PL），可通過β-消去機理以內(nèi)切或外切方式將褐藻酸鈉裂解為非還原端帶雙鍵的不飽和糖醛酸寡糖和不飽和糖醛酸單糖。根據(jù)褐藻膠裂解酶底物特異性差異可分為3 種類型：聚甘露糖醛酸（polyM）特異性裂解酶（EC 4.2.2.3）、聚古羅糖醛酸（polyG）特異性裂解酶（EC 4.2.2.11）和雙功能裂解酶（EC 4.2.2.-）[1]。根據(jù)序列相似性，褐藻膠裂解酶可劃分為7 個PL家族，即PL-5、-6、-7、-14、-15、-17和-18家族[2]。目前已從海洋和陸地細(xì)菌、海洋軟體動物和藻類中發(fā)掘多種褐藻膠裂解酶，但野生型褐藻膠裂解酶活力及產(chǎn)量一般較低，限制了其工業(yè)化應(yīng)用。采用基因工程菌表達重組酶可提高酶活力和產(chǎn)量，海洋細(xì)菌Thalassotalea crassostreae來源的外切型褐藻膠裂解酶基因（TcAlg1）已成功在大腸桿菌BL21（DE3）表達[3]。Flavobacteriumsp.strain UMI-01來源褐藻膠裂解酶基因（FlAlyA）在大腸桿菌中表達，重組褐藻膠裂解酶（rFlAlyA）較野生型提高了近8 倍[4]。經(jīng)畢赤酵母表達后高密度發(fā)酵，F(xiàn)lavobacteriumsp.H63褐藻膠裂解酶sagl（rSAGL）酶活力可達226.4 μg/mL（915.5 U/mL）[5]?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）是公認(rèn)安全（generally recognized as safe，GRAS）級菌株，其具有非致病性、高分泌、易于培養(yǎng)和易放大等優(yōu)點[6]，目前利用枯草芽孢桿菌表達褐藻膠裂解酶報道較少，并且Flavobacteriumsp.strain A1來源褐藻膠裂解酶A1-III在枯草芽孢桿菌中的表達水平低（0.3 mg/mL）[7]。因此，利用枯草芽孢桿菌作為表達系統(tǒng)提高重組褐藻膠裂解酶活力及產(chǎn)量有待進一步深入研究。

褐藻膠是由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronic acid，M）和α-L-古羅糖醛酸（α-L-guluronic acid，G）通過1,4-糖苷鍵聚合而成的酸性多糖。根據(jù)單糖組成的不同，可分為聚甘露糖醛酸（polyM）、聚古羅糖醛酸（polyG）和混合型（polyMG）褐藻膠3 種類型[8]。作為褐藻中含量最豐富的碳水化合物，褐藻膠占褐藻干質(zhì)量的10%～45%[9]。褐藻膠在食品和制藥行業(yè)中廣泛用作增稠劑和膠凝劑[10]，并具有修復(fù)受損皮膚[11]以及酶和細(xì)胞的固定[12]等功能特性。研究發(fā)現(xiàn)由褐藻膠降解所得褐藻寡糖具有抗氧化[13]、抑菌[14]、抗癌和免疫調(diào)節(jié)[15]等多種生理活性。化學(xué)與物理方法降解褐藻膠生產(chǎn)褐藻寡糖存在反應(yīng)條件劇烈、產(chǎn)物難以控制、能耗大、污染環(huán)境等缺點。酶法生產(chǎn)褐藻寡糖具有產(chǎn)物得率高、特異性強以及反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點且已成為研究熱點[16]。利用褐藻膠裂解酶Cel32酶解褐藻酸鈉可生產(chǎn)二糖、三糖等低聚合度（degree of polymerization，DP）的褐藻寡糖[17]。Bacillussp.Alg07褐藻膠裂解酶AlgA可在40 ℃下酶解褐藻酸鈉生產(chǎn)甘露糖醛酸二糖、三糖、四糖及古羅糖醛酸片段[18]；通過褐藻膠裂解酶TcAlg1酶解褐藻酸鈉可生產(chǎn)4-脫氧-L-赤型-5-己糖醛酸（4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronate，DEH）和低分子質(zhì)量古羅糖醛酸片段[3]。

黃桿菌FlAlyA（基因號AB898059）經(jīng)大腸桿菌[4]重組表達后酶活力為168 U/mL，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.176 mg/mL；經(jīng)短小芽孢桿菌[19]重組表達后比酶活力幾乎不變，表達量相比大腸桿菌表達高出約7.1 倍，但仍無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)褐藻寡糖需求?；谝陨涎芯窟M展，本研究將rFlAlyA在枯草芽孢桿菌中進行表達，通過高密度發(fā)酵實現(xiàn)rFlAlyA的高效生產(chǎn)，采用電噴霧電離-質(zhì)譜（electrospray ionization ion trap-mass spectrometry，ESI-MS）分析rFlAlyA降解褐藻酸鈉的褐藻寡糖組成，離子色譜分析相對含量。研究結(jié)果將為褐藻膠裂解酶的高效生產(chǎn)及制備褐藻寡糖提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌WB600和質(zhì)粒pWB980均由廣西大學(xué)韋宇拓課題組惠贈；細(xì)菌基因組提取試劑盒、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒、TransStart FastpfuDNA polymerase 北京全式金生物技術(shù)有限公司；ExTaqDNA Polymerase、低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)、DNA Marker 安諾倫（北京）生物科技有限公司；Phusion DNA polymerase 美國NEB公司；強陽離子交換層析柱料SP 美國GE Healthcare公司；卡那霉素 美國Inalco公司；Kieselgel 60硅膠板 德國Merck公司；甘露糖醛酸寡糖（DP：1～6） 青島博智匯力生物技術(shù)有限公司；其他試劑如無特殊說明均為分析純。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L；LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，KH2PO40.3 g/L，Na2HPO46 g/L，MgSO40.3 g/L；流加補料培養(yǎng)基：葡萄糖500 g/L，蛋白胨75 g/L，培養(yǎng)基中葡萄糖和蛋白胨分開滅菌，冷卻至室溫后混勻；SpII+乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸（ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid，EGTA）：SpII 200 mL，EGTA溶液（0.1 mol/L，pH 8.0）4 mL；SpII：T-base 200 mL，500 mg/mL葡萄糖溶液2 mL，12 mg/mL MgSO4g 3H2O溶液14 mL，10%酵母提取物2 mL，10 mg/mL酪蛋白氨基酸溶液2 mL，0.1 mol/L CaCl2溶液1 mL；T-base：(NH4)2SO42 g/L，K2HPO4g 3H2O 18.3 g/L，KH2PO46 g/L，檸檬酸三鈉1 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；Power Pac BasicTM型電泳儀、MyCycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）自動擴增儀 美國Bio-Rad公司；5 L發(fā)酵罐 上海國強生化工程有限公司；HZQ-X100恒溫雙層振蕩培養(yǎng)箱 江蘇太倉實驗設(shè)備廠；CBIO-GelPro凝膠成像分析系統(tǒng)北京賽百奧科技有限公司；JY92-II超聲波細(xì)胞粉碎機寧波新芝生物科技股份有限公司；GL-20B高速冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；PB21型pH計 德國賽多利斯公司；?KTA蛋白純化系統(tǒng) 美國GE Healthcare公司；ICS-5000+高效離子交換色譜（安倍脈沖檢測器）、CarboaPacTMPA1陰離子交換柱 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1rFlAlyA在枯草芽孢桿菌中的表達

褐藻膠裂解酶基因rFlAlyA由上海生工（北京）生物工程有限公司合成，參考You Chun等[20]方法構(gòu)建枯草芽孢桿菌重組表達載體。設(shè)計2 對引物（rFlAlyA-IF、rFlAlyA-IR和pWB-VF、pWB-VR），采用NEB Phusion DNA polymerase PCR擴增目的基因和表達載體。PCR程序為：98 ℃變性30 s，98 ℃退火10 s，72 ℃延伸90 s；30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

通過prolonged overlap extension-PCR（POE-PCR）擴增多聚體質(zhì)粒。PCR體系組成包括：dNTPs 0.2 mmol/L，插入片段2 ng/μL，載體和插入片段物質(zhì)的量比為1∶1；0.04 U/μL NEB Phusion DNA polymerase。PCR條件為：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸60 s，29 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

參考Zhang Xiaozhou等[21]的方法將多聚體質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌感受態(tài)。將保存于-80 ℃條件下的枯草芽孢桿菌WB600感受態(tài)細(xì)胞取出，37 ℃水浴解凍；取上述多聚體質(zhì)粒5～10 μL加入500 μL枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，加入等體積的SpII+EGTA，37 ℃孵育1.5 h，涂布于含20 μg/mL卡那霉素的平板，37 ℃倒置培養(yǎng)。挑取單菌落接種于20 mL LB液體培養(yǎng)基中37 ℃進行培養(yǎng)，每6 h取樣，6 000 r/min離心5 min，采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定上清液中褐藻膠裂解酶活力，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析目的基因表達情況。

1.3.2 高密度發(fā)酵

挑取單菌落接種于20 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜；以1%接種量轉(zhuǎn)接至100 mL LB培養(yǎng)基培養(yǎng)10～11 h得種子液，此時培養(yǎng)基內(nèi)的枯草芽孢桿菌處于對數(shù)生長期。5 L發(fā)酵罐中加入2 L發(fā)酵培養(yǎng)基，按照接種量5%進行接種發(fā)酵，發(fā)酵條件為：37 ℃，通氣量1.5 m3/（m3g min），攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min，28%氨水調(diào)節(jié)pH值至7.0。待碳源消耗殆盡時，采用DO-stat策略，維持發(fā)酵罐中葡萄糖質(zhì)量濃度低于2 g/L，當(dāng)溶氧高于限定值（40%～45%）時開始流加補料，速率為100～120 s/次。每6 h取樣，測定菌體密度（OD600nm）、褐藻膠裂解酶活力（DNS法）、蛋白含量（Lowry法），采用SDS-PAGE分析褐藻膠裂解酶表達情況。

1.3.3 rFlAlyA酶活力和蛋白含量測定

采用DNS法[22]。取100 μL適當(dāng)稀釋的酶液加入900 μL 0.3%褐藻膠底物中，50 ℃反應(yīng)10 min，加入750 μL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水中顯色10 min，迅速冷卻至室溫，540 nm波長下測定吸光度。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，計算反應(yīng)生成還原糖的量，在上述反應(yīng)條件下，每分鐘生成1 μmol還原糖所需要的酶量定義為1 個酶活力單位（U）。蛋白含量的測定參考Lowry等[23]的方法，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.3.4 rFlAlyA的純化

取飽和度60%～80%的(NH4)2SO4對高密度發(fā)酵上清液中的蛋白進行分級分離，收集目的蛋白沉淀并溶解于磷酸鹽緩沖液（pH 7.0，20 mmol/L），4 ℃透析12 h，10 000 r/min離心10 min并收集上清液。采用?KTA純化系統(tǒng)對上清液中目的蛋白進行純化，SP強陽離子交換柱經(jīng)20 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡后上樣，采用含75 mmol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0，20 mmol/L）等度洗脫目的蛋白，SDS-PAGE檢測目的蛋白純度。

1.3.5 rFlAlyA的酶學(xué)性質(zhì)測定

最適pH值的測定：選用50 mmol/L不同pH值的緩沖液（MES緩沖液，pH 5.5～6.5；磷酸鹽緩沖液，pH 6.0～8.0；MOPS緩沖液，pH 6.5～7.5；CHES緩沖液，pH 8.0～10.0；CAPS緩沖液，pH 10.0～11.0），按照DNS法測定褐藻膠裂解酶活力，以最大值為100%，分別計算各pH值條件下的相對酶活力。

pH值穩(wěn)定性的測定：采用50 mmol/L不同pH值的緩沖液（檸檬酸鹽，pH 3.0～6.0；MES緩沖液，pH 5.5～6.5；磷酸鹽緩沖液，p H 6.0 ～8.0；M O P S 緩沖液，pH 6.5～7.5；CHES緩沖液，pH 8.0～10.0；CAPS緩沖液，pH 10.0～11.0；Na2HPO4-NaOH緩沖液，pH 11.0～12.0）對酶液進行適當(dāng)稀釋，30 ℃水浴保溫30 min，立即冰水浴冷卻30 min，在最適pH值下采用DNS法測定殘余酶活力，以未經(jīng)處理的酶液為對照（100%），分別計算各pH值緩沖液處理后的相對殘余酶活力。

最適反應(yīng)溫度的測定：采用磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.5），在不同溫度下（30～70 ℃）采用DNS法測定褐藻膠裂解酶活力，以最大值為100%，分別計算各溫度處理條件下的相對酶活力。

熱穩(wěn)定性的測定：采用磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，p H 7.5）對酶液進行適當(dāng)稀釋，在不同溫度下（20～60 ℃）保溫30 min，立即冰水浴冷卻30 min，在最適溫度下采用DNS法測定殘余酶活力，以未經(jīng)處理的酶液為對照（100%），分別計算各溫度處理后的相對殘余酶活力。

1.3.6 rFlAlyA底物特異性及水解特性

以不同種類的多糖為底物測定rFlAlyA的底物特異性。采用DNS法測定酶活力，以polyM為底物時測定的酶活力為100%，分別計算rFlAlyA對各種底物的比酶活力和相對酶活力。底物包括：褐藻酸鈉、polyM、polyG、幾丁質(zhì)和瓊脂，各底物質(zhì)量濃度均為3 mg/mL。

以褐藻酸鈉、甘露糖醛酸二糖（M 2）、三糖（M3）、四糖（M4）、五糖（M5）和六糖（M6）作為底物分析rFlAlyA水解特性。酶解反應(yīng)條件為：磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.5）溶解褐藻膠和甘露糖醛酸寡糖（10 mg/mL），加酶量1 U/mL，50 ℃保溫12 h。分別在反應(yīng)不同時間點取樣，煮沸5 min終止反應(yīng)。樣品經(jīng)10 000 r/min離心10 min后上樣于Kieselgel 60硅膠板，將硅膠板置于展層劑中展開，用顯色劑完全浸潤硅膠板后吹干，烘烤至顯色。展層劑為正丁醇-甲酸-水（2∶1∶1，V/V），顯色劑為濃硫酸-甲醇（1∶9，V/V）。

1.3.7 褐藻寡糖制備條件優(yōu)化和酶解產(chǎn)物的分析

采用rFlAlyA酶解褐藻酸鈉制備褐藻寡糖并對酶解反應(yīng)條件進行優(yōu)化，考察底物質(zhì)量濃度（20、40、60、80、100 mg/mL和120 mg/mL）、加酶量（10、20、40、50、60、70 U/g）及酶解時間（0.5、1、2、3、4、8、12 h）對還原糖得率的影響。酶解反應(yīng)結(jié)束將酶解液于100 ℃加熱5 min終止反應(yīng)，采用DNS法測定反應(yīng)過程中還原糖含量。根據(jù)Li Haifeng等[5]方法取離心所得上清液過0.22 μm微孔濾膜并收集濾液，凍干至恒質(zhì)量。褐藻寡糖的質(zhì)量為凍干物質(zhì)量減去溶液中所含磷酸鹽緩沖液中鹽的質(zhì)量，底物轉(zhuǎn)化率為褐藻寡糖質(zhì)量占褐藻膠質(zhì)量的百分比。

取經(jīng)條件優(yōu)化后酶解所得濾液經(jīng)脫鹽處理后濃縮、凍干，采用ESI-MS分析褐藻寡糖組成。電離源為ESI，噴霧電壓4 kV，毛細(xì)管溫度350 ℃，管透鏡120 V，鞘氣壓力45 AU，質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 500。

采用離子色譜測定各寡糖的相對含量，色譜柱為CarboPac PA-1 column（4 mm×250 mm），柱溫為30 ℃，流速為1 mL/min；洗脫方式為0～60 min內(nèi)流動相A（100 mmol/L NaOH）從100%降至0%，流動相B（100 mmol/L NaOH+1 mol/L NaOAc）從0%升至100%。標(biāo)準(zhǔn)品為不同DP甘露糖醛酸，未知的寡糖樣品根據(jù)與其保留時間最近的標(biāo)準(zhǔn)品進行定量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

SDS-PAGE和薄層層析圖片采用Photoshop CS6處理，相關(guān)數(shù)據(jù)采用Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 rFlAlyA的高效表達和高密度發(fā)酵

分別利用引物擴增編碼成熟蛋白（rFlAlyA）的核酸序列和pWB980載體骨架序列，得到5’和3’端分別帶有同源序列的目的基因和表達載體。將POE-PCR擴增得到的含有目的基因的多聚體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌WB600中，成功篩選出1 株高產(chǎn)褐藻膠裂解酶且穩(wěn)定的重組菌株。采用5 L發(fā)酵罐進行高密度發(fā)酵培養(yǎng)。rFlAlyA高密度發(fā)酵歷程如圖1a所示，采用SDS-PAGE對發(fā)酵液中rFlAlyA的表達進行分析（圖1b）。經(jīng)高密度發(fā)酵48 h后，rFlAlyA最高酶活力達2 550 U/mL，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為4.5 mg/mL。SDS-PAGE分析表明，發(fā)酵液中的主條帶分子質(zhì)量約為30 kDa，且隨著發(fā)酵時間的延長，主條帶逐漸加深。

圖1 重組褐藻膠裂解酶rFlAlyA高密度發(fā)酵歷程（a）及發(fā)酵上清液SDS-PAGE分析（b）Fig.1 Time course of high-density fermentation of recombinant rFlAlyA (a)and SDS-PAGE analysis of proteins in the fermentation supernatant (b)

采用枯草芽孢桿菌表達黃桿菌來源褐藻膠裂解酶rFlAlyA，與文獻中已報道的褐藻膠裂解酶表達水平對比發(fā)現(xiàn)，褐藻膠裂解酶rSAGL在畢赤酵母表達后酶活力為915.5 U/mL，蛋白質(zhì)量濃度為0.23 mg/mL[5]；Bacillussp.產(chǎn)褐藻膠裂解酶Alg07比酶活力為8 306.7 U/mg，然而其發(fā)酵上清液中酶活力僅為5 1 0 U/m L[18]；Flavobacteriumsp.strain A1褐藻膠裂解酶A1-III在枯草芽孢桿菌中的表達量為0.3 mg/mL[7]。本研究中褐藻膠裂解酶rFlAlyA經(jīng)枯草芽孢桿菌表達后的酶活力顯著高于目前已報道的褐藻膠裂解酶的酶活力，達到最高水平。

2.2 rFlAlyA的純化

如表1所示，經(jīng)飽和度60%～80%的(NH4)2SO4分級分離后酶液比酶活力為728.3 U/mg，純化倍數(shù)為1.5 倍；最終經(jīng)SP柱純化后比酶活力為1 768.6 U/mg，純化倍數(shù)為3.8 倍，回收率為20.6%。

表1 rFlAlyA純化指標(biāo)Table 1 Summary of the purification process of rFlAlyA

圖2 褐藻膠裂解酶rFlAlyA純化圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purified rFlAlyA

由圖2可知，經(jīng)SDS-PAGE分析鑒定該酶分子質(zhì)量約30 kDa。不同來源的褐藻膠裂解酶根據(jù)分子質(zhì)量大小可分成3 類：低分子質(zhì)量（25～30 kDa）、中分子質(zhì)量（≈40 kDa）和高分子質(zhì)量（＞60 kDa）[24]。Pseudoalteromonassp.SM0524來源的褐藻膠裂解酶AlySJ-02[24]和Agarivoranssp.JAM-A1m來源的褐藻膠裂解酶Alm[25]分子質(zhì)量分別為32 kDa和31 kDa。本研究純化的褐藻膠裂解酶rFlAlyA分子質(zhì)量與二者接近，同屬于低分子質(zhì)量褐藻膠裂解酶。Vibriosp.QY105褐藻膠裂解酶AlyV5[26]分子質(zhì)量為37 kDa，屬于中分子質(zhì)量褐藻膠裂解酶。Shewanellasp.Kz7褐藻膠裂解酶Oal17[27]分子質(zhì)量為82 kDa，屬高分子質(zhì)量褐藻膠裂解酶。

2.3 rFlAlyA酶學(xué)性質(zhì)

如圖3所示，褐藻膠裂解酶rFlAlyA的最適pH值為7.5，在pH 4.0～11.0范圍內(nèi)處理30 min可保持80%以上的酶活力；最適溫度為50 ℃，可在50 ℃及以下處理30 min保持80%以上的酶活力。

已報道褐藻膠裂解酶最適pH值大多在7.5～8.0范圍內(nèi)[18]，天然黃桿菌來源褐藻膠裂解酶FlAlyA及在大腸桿菌中表達的褐藻膠裂解酶recFlAlyA最適pH值為7.8，在pH 7.8～10.5范圍內(nèi)保持80%以上的酶活力[4]。rFlAlyA的最適pH值與其相近，pH值穩(wěn)定范圍較recFlAlyA更寬。大部分PL-7家族褐藻膠裂解酶在較窄pH值范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，如來源于Pseudoalteromonassp.SM0524的褐藻膠裂解酶AlySJ-02在pH 7.0～10.0保持穩(wěn)定[24]，而Isoptericola halotoleransCGMCC5336的褐藻膠裂解酶AlyIH在pH 7.0～8.0保持穩(wěn)定[28]。良好的pH值穩(wěn)定性使rFlAlyA能適應(yīng)和滿足工業(yè)生產(chǎn)中不同pH值環(huán)境條件。天然黃桿菌來源褐藻膠裂解酶FlAlyA及在大腸桿菌中表達的褐藻膠裂解酶recFlAlyA最適溫度約為55 ℃，在45 ℃以下保持穩(wěn)定[4]；rFlAlyA的最適溫度與其相比降低了約5 ℃，而溫度穩(wěn)定性范圍提高了5 ℃。大部分內(nèi)切型褐藻膠裂解酶最適溫度在30～45 ℃之間，如Vibriosp.W13褐藻膠裂解酶Algb[29]和Vibriosp.JAM-A9m褐藻膠裂解酶rA9mT[30]最適溫度均為30 ℃，熱穩(wěn)定性較差。少數(shù)褐藻膠裂解酶具有較好的熱穩(wěn)定性，如Nitratiruptorsp.SB155-2的褐藻膠裂解酶最適溫度為70 ℃[31]，在67 ℃處理30 min后可保持50%的酶活力。熱穩(wěn)定性較好的褐藻膠裂解酶rFlAlyA具有較大的應(yīng)用潛力。

2.4 rFlAlyA底物特異性及水解特性

圖4 褐藻膠裂解酶rFlAlyA酶解甘露糖醛酸寡糖（DP=2～6）（a）及褐藻膠（b）產(chǎn)物分析Fig.4 Analysis of the hydrolysates of mannonate oligosaccharides(DP = 2–6) (a) and sodium alginate (b) by rFlAlyA

rFlAlyA可降解褐藻酸鈉、polyM和polyG，對polyM的相對酶活力最高（100%），對polyG相對酶活力較低（13%），不水解幾丁質(zhì)和瓊脂（數(shù)據(jù)未列出）。通過對rFlAlyA裂解不同DP的甘露糖醛酸寡糖（M2～M6）的產(chǎn)物進行分析（圖4a），該酶無法水解M2，可裂解M3產(chǎn)DEH和甘露糖醛酸二糖。經(jīng)薄層層析分析rFlAlyA酶解褐藻酸鈉歷程（圖4b），在酶解前期即產(chǎn)生不同DP的褐藻寡糖，隨著酶解時間的延長，酶解12 h后，產(chǎn)物以M2～M5及DP更高的寡糖為主。

rFlAlyA可特異性地降解polyM，屬于polyM特異性裂解酶。M3是褐藻膠裂解酶rFlAlyA可裂解的最短鏈底物，該酶以內(nèi)切方式從還原端裂解M3產(chǎn)生DEH和M2，DEH不顯色[32]。該酶在酶解歷程的最初階段迅速產(chǎn)生不同DP的褐藻寡糖，并隨酶解時間的延長低分子質(zhì)量褐藻寡糖含量逐漸增加，表明該酶為內(nèi)切型褐藻膠裂解酶。已報道的內(nèi)切型polyM特異性裂解酶，如Pseudomonassp.E03褐藻膠裂解酶AlgA[33]和Pseudomonassp.strain KS-408褐藻膠裂解酶AlyA[34]，酶解產(chǎn)物主要為DP=2～5的褐藻寡糖；Flavobacteriumsp.來源的商品酶AlyDW11裂解褐藻酸鈉產(chǎn)生DP=5～7的較高聚合度的褐藻寡糖[35]；Vibriosp.W13褐藻膠裂解酶Alg7A酶解褐藻酸鈉則主要產(chǎn)生三糖[36]。

2.5 褐藻寡糖制備條件優(yōu)化和產(chǎn)物的組成分析

底物質(zhì)量濃度、加酶量及酶解時間對rFlAlyA酶解褐藻酸鈉制備褐藻寡糖的影響如圖5所示。隨著底物質(zhì)量濃度的增加，酶解液中的還原糖質(zhì)量濃度逐漸增加，底物轉(zhuǎn)化率降低。綜合考慮選擇100 mg/mL的底物質(zhì)量濃度為較優(yōu)條件（圖5a）。隨加酶量的增加，酶解反應(yīng)產(chǎn)生的還原糖質(zhì)量濃度逐漸增加，當(dāng)加酶量為50 U/g時，酶解液中還原糖質(zhì)量濃度基本保持不變。因此，選擇50 U/g為較適加酶量（圖5b）。在酶解初期（0～1 h），褐藻膠裂解酶rFlAlyA以內(nèi)切方式酶解褐藻酸鈉產(chǎn)生褐藻寡糖，還原糖含量快速增加；酶解4 h后還原糖質(zhì)量濃度達到最高33 mg/mL。隨著酶解時間的繼續(xù)延長，酶解液中還原糖質(zhì)量濃度無顯著變化，因此選擇4 h為酶解最優(yōu)時間（圖5c）。

圖5 底物質(zhì)量濃度（a）、加酶量（b）和酶解時間（c）對rFlalyA酶解褐藻酸鈉的影響Fig.5 Effects of substrate concentration (a), enzyme dosage (b) and hydrolysis time (c) on alginate hydrolysis by rFlAlyA

采用優(yōu)化后條件制備褐藻寡糖，酶解4 h后，還原糖質(zhì)量濃度達到最高33 mg/mL，通過凍干計算得到rFlAlyA對褐藻膠的轉(zhuǎn)化率為70.1%。Li Haifeng等[5]采用褐藻膠裂解酶rSAGL酶解褐藻膠產(chǎn)褐藻寡糖，酶解32 h后還原糖質(zhì)量濃度為9.51 mg/mL，底物轉(zhuǎn)化率為97.2%。Zhu Benwei等[17]采用褐藻膠裂解酶Cel32酶解褐藻酸鈉72 h后還原糖質(zhì)量濃度為25.2 mg/mL。可見，rFlAlyA裂解褐藻酸鈉至基本完全所需酶解時間更短，效率更高。為進一步確定酶解產(chǎn)物的組成，采用ESI-MS對酶解所得褐藻寡糖進行組成分析。如圖6所示，褐藻膠經(jīng)rFlAlyA酶解后的產(chǎn)物組成包括單糖（DEH）、二糖（[DP2-H]-）、三糖（[DP3-H]-）、四糖（[DP4-H]-）、五糖（[DP5-H]-）、六糖（[DP6-H]-）、七糖（[DP7+2Na-5H]-）和八糖（[DP8+4Na-5H]-）。通過離子色譜測定各寡糖的相對含量，主要檢出2～8糖，寡糖的相對比例如表2所示，其中三糖比例最高，七糖最少。

圖6 褐藻酸鈉酶解產(chǎn)物分析Fig.6 Analysis of oligosaccharide composition in alginate hydrolysate by rFlAlyA

表2 各寡糖的相對含量Table 2 Relative contents of oligosaccharides in alginate hydrolysate

3 結(jié) 論

本實驗利用枯草芽孢桿菌成功實現(xiàn)了黃桿菌來源褐藻膠裂解酶基因rFlAlyA的高效表達，采用高密度發(fā)酵最高酶活力達2 550 U/mL，顯著高于目前已報道褐藻膠裂解酶活力的最高水平。該酶具有良好的pH值穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性，屬于polyM特異性內(nèi)切型褐藻膠裂解酶，其可裂解的最短鏈底物為M3。該酶對褐藻膠轉(zhuǎn)化效率顯著高于已報道褐藻膠裂解酶，酶解4 h還原糖質(zhì)量濃度可達33 mg/mL，酶解產(chǎn)物DP為1～8，其中三糖含量最高。因此，枯草芽孢桿菌可用于褐藻膠裂解酶的高效生產(chǎn)并且在褐藻寡糖制備中具有廣闊的應(yīng)用前景。