皺皮木瓜腐敗微生物的分離鑒定

黃 榮，王曉麗，王兆升,*，李 游，方雙杰

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；2.山東農業工程學院食品科學與工程學院，山東 濟南 250100）

皺皮木瓜（Chaenomeles speciosa(Sweet) Nakai），多年生落葉小喬木，薔薇科木瓜屬植物，是我國南北方普遍種植的具有觀賞價值的果樹資源[1]，主要分布于山東、安徽、甘肅、重慶、云南、浙江等省[2]。其果實含有豐富的營養及功能成分，如碳水化合物、蛋白質、VC、胡蘿卜素、礦物質、多糖、酚類化合物、黃酮、齊墩果酸、熊果酸、皂甙和有機酸等，藥食兼用。據報道，皺皮木瓜中的酚類化合物、黃酮等具有消炎、抑菌、抗氧化和抗腫瘤的作用[3]。齊墩果酸和熊果酸具有抗腫瘤[4]、抗炎、抗高脂血癥[5]和抑制α-葡萄糖苷酶[6]的作用。鑒于皺皮木瓜較高的食用和藥用價值，其深受消費者青睞。但皺皮木瓜存在采后極易受到微生物侵染而腐敗變質的問題，極大地制約了皺皮木瓜產業的發展。

引起果實腐敗的微生物主要是細菌和真菌。腐敗微生物入侵果實主要通過代謝產生果膠酶、纖維素酶等細胞壁降解酶來降解果實中的多糖、纖維素、半纖維素和果膠，將上述物質分解成水和其他微生物所需的成分[7]，果實細胞中的營養物質流出，進而被微生物所利用，致使果實腐敗變質。常見的果實腐敗微生物有歐氏桿菌（Erwinia carotovora）、芽孢桿菌（Bacillus）、灰葡萄孢菌（B.cinerea）、黑根霉（Rhizopus nigricans）、黑曲霉（Aspergillus niger）[8]、皮落青霉（Penicillium crustosum）、鏈格孢菌（Alternaria alternata）、粉紅聚端孢（Trichoderma roseum）[9]、爪甲曲霉（Aspergillus unguis）[10]、青霉（Penicillium）、鐮孢霉菌（Fusarium）[11]等，種類繁多，而且不同果實的致腐微生物種類差別也很大。目前關于皺皮木瓜致腐微生物的研究鮮有報道，因此有必要對導致皺皮木瓜腐敗的微生物進行分離鑒定，以便根據致腐微生物的特性進行針對性抑制。

本研究以皺皮木瓜為原料，采用組織分離法對皺皮木瓜的致腐微生物進行分離純化，觀察其菌落形態，采用形態學和分子生物學等方法對其進行鑒定，旨在明確皺皮木瓜中腐敗微生物菌群，以期為皺皮木瓜貯藏過程中的腐敗控制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皺皮木瓜采摘自山東省臨沂市沂州木瓜研究所，成熟度、大小相近，無病害、無機械損傷。霉菌培養采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基、細菌培養采用營養瓊脂（nutrient agar，NA）培養基和營養肉湯（nutrient broth，NB）培養基，酵母菌培養采用酵母提取物蛋白胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基。

細菌基因組DNA提取試劑盒（DP302） 天根生化科技有限公司；真菌DNA提取試劑盒、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產物純化試劑盒北京全式金生物技術有限公司；擴增引物 上海華大基因有限公司；微生物培養基所需材料 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

XFS-280A手提式壓力蒸汽滅菌鍋 浙江新豐醫療器械有限公司；SW-CJ-1CU超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療器械一廠；CX31生物顯微鏡 日本奧林巴斯公司；瓊脂糖凝膠電泳、PCR儀 伯樂生命醫學產品上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 腐敗微生物的分離純化

挑選無病蟲害、無機械傷、成熟度一致的果實，表面用清水清洗后立即放入二氧化氯溶液中消毒1 min，并用無菌水沖洗，晾干，將其在4 ℃恒溫環境進行貯藏。待皺皮木瓜果實表面出現深褐色斑點時，切取健康部位和病變部位的交界處組織25 g放置于75%乙醇溶液中浸泡30 s，取出后，用無菌水反復沖洗3 次，然后用滅菌紗布吸干組織塊。將上述組織塊放入裝有225 mL無菌水的三角瓶中，置于恒溫水浴振蕩器中振蕩1 h，使微生物細胞充分分散均勻，制成木瓜懸浮液。將木瓜懸浮液依次稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5。分別吸取不同稀釋度的木瓜懸浮液0.1 mL于PDA、NA、YPD培養基，涂布均勻，每個稀釋度涂布3 個平板。將PDA、YPD于28 ℃恒溫培養箱中培養3～5 d，NA于37 ℃培養箱中培養1～2 d。待培養結束后，根據菌落形態、顏色、大小的不同，挑取各個平板上不同的菌落進行劃線分離，直至得到純培養物[12]。對于PDA平板上菌落，采用點植法進行進一步純化培養，重復培養3 代。將分離得到的純菌于4 ℃冰箱中保存備用。

1.3.2 回接實驗

將新鮮、健康的皺皮木瓜表面清洗，然后立即放入二氧化氯溶液中消毒1 min，用無菌水沖洗，晾干。于無菌操作間，用打孔器在新鮮皺皮木瓜腰部對稱打出若干小孔。在打孔處分別接入20 μL所篩選的病原菌懸浮液，以無菌生理鹽水作為對照。為避免其他雜菌污染，將接種病原菌的皺皮木瓜用保鮮膜包裹。將上述木瓜放置于28 ℃恒溫環境中，觀察貯藏過程中組織變化和發病情況，根據腐敗情況最終確定該菌是否為主要致病菌[13]。從回接后腐爛的組織上再次分離純化，判斷是否與最初純化的菌種一致。

1.3.3 皺皮木瓜腐敗微生物的鑒定

1.3.3.1 細菌鑒定

將從皺皮木瓜貯藏初期分離純化后的細菌菌株在NA培養基上劃線培養1～2 d后，觀察菌株的菌落形態，包括菌落大小、形狀、顏色、透明度、邊緣結構、表面光滑度、菌落隆起形狀、表面狀態等，將觀察到的菌落形態與標準菌株相比較，參照文獻[14]進行形態學鑒定。同時，參照文獻[14]對所分離的細菌菌株的生理生化特性進行鑒定，主要包括過氧化氫酶活性實驗、淀粉水解實驗、葡萄糖水解實驗、阿拉伯糖水解實驗、木糖水解實驗、甘露醇水解實驗、V-P實驗、NaCl耐受性實驗等。

挑取細菌平板上的單菌落，接種于N B 培養基中，37 ℃搖床培養12 h。取2 mL菌液10 000×g離心1 min后棄去上清液，按照天根公司的細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取2 株細菌的基因組DNA。采用擴增細菌的16S rDNA通用引物，前引物為63F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、后引物為1387R（5’-CCCGGGATCCAAGCTTAAG-3’）擴增目標細菌的16S rDNA，引物由北京六合華大科技有限公司合成。PCR擴增體系（50 μL）為：模板DNA 3 μL，5×Buffer（含Mg2+）10 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）4 μL，10 μmol/L 27 F和1492 R引物各1 μL，酶1 μL，ddH2O 30 μL。PCR程序為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，循環30 次；72 ℃修復延伸5 min，4 ℃終止反應。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統觀察電泳條帶，確定有無目的性條帶出現。然后將PCR產物寄往生工生物工程（上海）股份有限公司測序，PCR產物用PCR引物直接測序。測序完成后，將得到的序列在NCBI的GenBank中進行BLAST分析，并進行多序列比對分析，選取序列相似性較高的標準菌株的基因序列，使用MEGA 7.0軟件進行系統發育分析，采用鄰接法構建系統發育樹。

1.3.3.2 霉菌鑒定

將分離純化后的霉菌菌株接種于PDA平板培養基上，28 ℃培養箱中培養6～7 d，制備顯微鏡載玻片。觀察并記錄菌落形態，包括菌落形狀、大小、生長速度、菌落正反面顏色、菌絲顏色及形狀、可溶性色素、滲出物的顏色等，參考文獻[15-16]進行形態學鑒定。

將霉菌接種于PDA培養基上，28 ℃培養6～7 d，從培養基上刮取新鮮菌絲，采用CTAB法進行霉菌總DNA的提取。霉菌采用真菌ITS通用引物（ITS1：5’-T C C G TA G G T G A A C C T G C G G-3’和I T S 4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）擴增ITS區的rDNA序列。反應體系50 μL（2×PCR Master Mix 25 μL，10 μmol/L引物ITS1和ITS4各2.0 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O補足50 μL）。PCR程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，58 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統觀察電泳條帶，確定有無目的性條帶出現。然后將PCR產物寄往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序完成后，將得到的序列在NCBI的GenBank中進行BLAST分析，并進行多序列比對分析，選取序列相似性較高的標準菌株的基因序列，使用MEGA 7.0軟件進行系統發育分析，采用鄰接法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 回接實驗結果

從腐敗的皺皮木瓜中初步分離純化出2 株細菌、6 株霉菌，沒有分離出酵母菌。將分離出的菌株編號，分別為細菌（細菌X1、細菌X2）和霉菌（霉菌M1、霉菌M2、霉菌M3、霉菌M4、霉菌M5、霉菌M6），并將這8 株菌種回接到新鮮、健康并經過清洗消毒的皺皮木瓜表面，結果如圖1所示。

圖1 皺皮木瓜病原菌回接實驗結果Fig.1 Back inoculation of pathogenic microbes from C.speciosa

由圖1可以看出，細菌X1和X2回接到健康的皺皮木瓜表皮后，表面出現褐色斑點。斑點最初為淺褐色，后期變為深褐色，并逐漸向四周擴展，皺皮木瓜變軟。霉菌M1回接到皺皮木瓜表皮后，接種部位長出白色菌絲，病健交界部位為淺黃色，出現腐敗現象，有很強的霉味。霉菌M2回接到皺皮木瓜表皮后發病，初期出現淡褐色圓形斑點，后變成深褐色，并逐漸向外擴展，變軟腐敗，具有腐敗的氣味。霉菌M3回接到皺皮木瓜表面后，表面先出現淺褐色斑點，隨著貯藏時間的延長，逐漸變為深褐色，中心出現青綠色霉層。霉菌M4、霉菌M5和霉菌M6回接后，針刺部位失水變硬，出現褐色，并沒有表現出霉變現象。將回接后皺皮木瓜腐敗的部位重新進行微生物的分離，分離純化后的菌株均與所接種菌株一致。由此可以確定，細菌X1、細菌X2和霉菌M1、霉菌M2、霉菌M3是引起皺皮木瓜腐敗的微生物。

2.2 腐敗微生物鑒定結果

2.2.1 細菌X1鑒定結果

圖2 細菌X1鑒定結果Fig.2 Identification of bacterial strain X1

由圖2a可以看出，細菌X1菌落呈現乳白色，表面光滑、濕潤、有光澤，呈圓形，中間凸起，不擴展，易挑取。在光學顯微鏡下，細菌呈現長桿狀，單個成對或呈短鏈狀排列，能形成芽孢。生理生化鑒定結果表明，細菌X1能水解淀粉，V-P實驗呈陽性，過氧化氫酶實驗呈陽性，能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇，對NaCl的耐受性為7%。根據X1的菌落形態及生理生化檢驗結果，可初步確定細菌X1為芽孢桿菌屬。

通過16S rDNA通用引物擴增細菌X1菌株的16S rDNA序列，將PCR產物進行測序。將測得的序列上傳至NCBI基因庫中，與已登錄的該屬其他標準菌株序列進行多重比對分析。由圖2b可知，細菌X1與彎曲芽孢桿菌（B.flexus）遺傳距離較近，與巨大芽孢桿菌（B.megaterium）遺傳距離最近。其菌落形態和生理生化反應結果也與B.megaterium相符，因此，可以確定細菌X1為B.megaterium。

2.2.2 細菌X2鑒定結果

圖3 細菌X2鑒定結果Fig.3 Identification of bacterial strain X2

由圖3a可以看出，細菌X2菌落不規則，乳白色至奶油色不透明，表面褶皺偏濕潤，中央扁平，邊緣呈放射狀，無暈環，桿狀，單生或短鏈狀。細菌X2的生理生化鑒定結果表明：能水解淀粉，V-P實驗呈陽性，過氧化氫酶實驗呈陽性，能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇，對NaCl的耐受性為7%。X2的菌落形態及生理生化檢驗結果與芽孢桿菌屬細菌一致，可初步確定細菌X2為芽孢桿菌屬。

通過16S rDNA通用引物擴增細菌X2菌株的16S rDNA序列，將PCR產物進行測序。將測得的序列上傳至NCBI基因庫中，與已登錄的該屬的其他標準菌株序列進行BLAST分析并構建系統發育樹。由圖3b可知，細菌X2與假蕈狀芽孢桿菌（B.pseudomycoides）親緣關系最近。其菌落形態和生理生化反應結果也與B.pseudomycoides相符，因此鑒定細菌X2為B.pseudomycoides。

Bacillus細菌也會引起其他果蔬的腐敗，嗜氣芽孢桿菌（B.aerophilus）和類芽孢桿菌（P.agaridevorans）是腐敗楊梅的主要病原菌[17]。此外，Bacillus在腐敗的生菜[18]、胡蘿卜、黃瓜、洋蔥、西紅柿[19]等均有發現。

2.2.3 霉菌M1鑒定結果

圖4 霉菌M1鑒定結果Fig.4 Identification of mold strain M1

由圖4a可知，霉菌M1菌落表面具有放射狀溝紋，呈致密絨狀。菌落最初暗黃綠色，后期變為暗黃綠色至藍綠色，質地絲絨狀，菌絲體白色，背面呈現暗黃色。分生孢子不對稱，呈扁圓形或圓形，分生孢子梗頂端有1～2 條支鏈，分生孢子梗平滑、細長。由霉菌M1的菌落形態及顯微鏡觀察結果，并參照文獻[16]，可初步判定霉菌M1為青霉屬。

通過真菌ITS通用引物擴增霉菌M1菌株的序列并進行測序。將測得的序列上傳至NCBI基因庫中，與已登錄的該屬其他標準菌株序列進行BLAST分析并構建系統發育樹。如圖4b所示，霉菌M1與P.crustosum的同源性最高。其菌落形態及顯微觀察結果也與P.crustosum相符，因此鑒定霉菌M1為P.crustosum。P.crustosum也會引起甜櫻桃[20]、靈武長棗[21]、新疆賽買提杏[22]等果實的腐爛。

2.2.4 霉菌M2鑒定結果

圖5 霉菌M2鑒定結果Fig.5 Identification of mold strain M2

由圖5a可以看出，霉菌M2菌落呈灰綠色，表面粗糙，具有放射狀溝紋，背面藍黑色，菌落局限，邊緣整齊，菌絲有橫隔，分生孢子呈卵形、球形、桿狀。根據霉菌M2的形態學特征，并參照文獻[16]，可初步判定霉菌M2為枝孢菌屬。

以真菌ITS通用引物對霉菌M2的菌株序列擴增，并進行測序。將測序結果在NCBI基因庫中進行比對，下載已登錄的該屬的其他標準菌株序列，進行BLAST比對分析并構建系統發育樹。如圖5b所示，霉菌M2與枝孢霉菌（Cladosporium velox）二者位于同一分支，同源性最高。其形態學鑒定結果也與C.velox一致，因此鑒定霉菌M2為C.velox。有研究發現，Cladosporium也是導致蓮藕[23]、藍莓[24]、獼猴桃[25]腐敗的微生物。

2.2.5 霉菌M3鑒定結果

圖6 霉菌M3鑒定結果Fig.6 Identification of mold strain M3

霉菌M3的形態學鑒定結果如圖6a所示，菌落正面呈灰綠色，細絨狀，周圍繞以白邊，具有多道同心環紋，背面呈暗黃色，由顯微鏡觀察結果可以看出，分生孢子梗頂端呈掃帚狀，具有不對稱小梗，分生孢子密集一簇，近球形，壁平滑。根據霉菌M3的菌落及顯微鏡觀察結果，并查閱文獻[16]可知，霉菌M3特征與青霉屬特征類似。

將霉菌M3的PCR產物進行測序，并將測得的序列上傳至NCBI基因庫中與該屬的其他標準菌株序列進行BLAST比對分析，構建系統發育樹（圖6b）。霉菌M3與擴展青霉（P.expansum）的親緣關系較近，可信度較高。結合其形態學鑒定結果，判定霉菌M3為P.expansum。

P.expansum屬于半知菌亞門，是造成果蔬采后腐爛的主要致腐菌[26]。其致腐能力較強，可以局部改變pH值[27]，有利于其成功侵染果實。據文獻報道，P.expansum還可引起蘋果[28]、梨[29]、桃[30]等果實腐爛，造成巨大的經濟損失。

3 結 論

皺皮木瓜果實的腐敗變質是幾種病原菌共同作用的結果，通過形態鑒定、分子生物學鑒定，確定引起皺皮木瓜腐敗的微生物主要有B.megaterium、B.pseudomycoides、P.crustosum、C.velox、P.expansum。本研究結果可以為皺皮木瓜貯藏過程中的微生物腐敗進程和機制提供生物學證據，為進一步開發安全、綠色、高效的皺皮木瓜防腐保鮮技術提供理論支持。