超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜鑒定嗜熱鏈球菌發酵乳中脂質構成

章 麗，高 潔，劉松雁，桑亞新,*，王向紅,*

（1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071001；2.石家莊市畜產品和獸藥飼料質量檢測中心，河北 石家莊 050051）

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）屬于革蘭氏陽性菌，具有兼性厭氧的特征，是一種重要的工業用乳酸菌，被廣泛用于酸奶、奶酪等發酵乳制品[1]；同時，嗜熱鏈球菌還具有重要的益生特性，具有調節腸道內菌群平衡、提高免疫力、提升抗氧化水平、抑制炎癥等功能作用[2-3]。嗜熱鏈球菌對發酵產品的營養[4]、物化特性[5]和氣味特征[6-7]等品質的形成具有重要意義，已引起廣大學者的興趣并進行了相關深入研究，為嗜熱鏈球菌的應用和產品開發奠定了良好的基礎。

脂質作為嗜熱鏈球菌發酵乳中重要營養成分，其組分、分子結構鮮有報道，這主要是因為脂質種類繁多、結構復雜且含量差異大，傳統的薄層色譜和氣相色譜技術難以完成有效的分離、鑒定[8]。隨著脂質組學技術的出現、發展和完善，為乳制品中脂質組分分析鑒定提供了有力的技術支撐和分析手段，脂質組學是一門對生物體系脂質進行全面系統分析的研究學科，利用先進儀器實現對給定基質中脂質進行快速、高通量分析鑒定是其重要研究內容之一[9-10]，為乳品中復雜、繁多的脂質組分分析、鑒定提供強有力的技術支撐。

目前，脂質組學技術應用于乳品分析越來越受到重視，為乳品脂質學科發展和完善提供新技術、新思路、新方向。Li Qiangqiang等[11]基于超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/orbitrap high resolution mass spectrometry，UPLC-Q-Orbitrap HRMS）分析了山羊奶、大豆奶和牛奶中脂質組分構成，明確了14 種差異性脂質標記物，探索牛乳摻假甄別新技術。Wang Lina等[12]基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析了母乳、牛乳和羊乳脂質組分構成，明確了13 類脂質組分和200 種差異性脂質組分，為開發新型嬰幼兒乳制品提供了新思路。Li Mohan等[13]采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜確定驢初乳和驢乳13 類脂質中335 種組分構成，明確了60 種差異脂質組分，為驢乳制品開發明確了新方向。但是，對乳品脂質組學的研究主要集中在原料乳脂質品質分析，尚未涉及到發酵乳等深加工乳制品脂質研究。目前，該領域的研究已成為乳品領域重要研究方向。

本研究采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析嗜熱鏈球菌發酵乳中脂質組分，明確樣品中脂質組分分布、分子結構，旨在為嗜熱鏈球菌的應用和新型乳制品開發及乳品脂質組學進一步發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳 河北三元食品有限公司；嗜熱鏈球菌S2河北一然生物科技有限公司提供；蔗糖 市售。

乙腈、甲醇（均為色譜純） 美國Fisher公司；甲酸、異丙醇、甲酸銨、氯仿（均為優級純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Q-Exactive Q-Orbitrap HRMS儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；UltiMate 3000 HPLC儀 日本Shimadzu公司；XP 105分析天平 瑞士Mettler公司；Milli-Q Advantage A10超純水機 美國Millipore公司；SB-5200DT超聲波清洗機 寧波新芝生物科技有限公司；TYXH-I旋渦振蕩器 上海汗諾儀器有限公司；TGL-16MS臺式高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；LNG-T98冷凍濃縮離心干燥器 太倉市華美生化儀器廠；Tissuelyser-48多樣本組織研磨機 上海凈信實業發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵乳制備

牛乳中加入6.0%蔗糖，攪拌均勻，待蔗糖溶化后，在5 Pa壓力下進行均質化處理，將處理好的牛乳98 ℃加熱15 min，立即轉入水浴中冷卻至約35 ℃，接種0.03%嗜熱鏈球菌S2，將接種嗜熱鏈球菌的牛乳加入1 000 mL無菌瓶中，42 ℃發酵至pH值達到4.2，再于4 ℃冷藏24 h，制得嗜熱乳酸菌發酵乳，-24 ℃貯存，用于分析測定。

1.3.2 脂質提取

稱取60 mg嗜熱鏈球菌發酵乳，加入2 個小鋼珠，-20 ℃放置2 min預冷，加入研磨機中，60 Hz研磨2 min；加300 μL氯仿，渦旋30 s，超聲提取10 min，-20 ℃靜置20 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取200 μL下層氯仿層裝入樣品小瓶中；在取完下層溶液的離心管中繼續加入300 μL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液，旋渦振蕩30 s，冰水浴中超聲提取10 min；-20 ℃靜置20 min后，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取300 μL下層氯仿，放入原來樣品瓶中揮干；揮干后脂質樣品用200 μL異丙醇-甲醇（1∶1，V/V）復溶（渦旋30 s，超聲3 min），轉至1.5 mL離心管中，-20 ℃靜置2 h；12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取150 μL上清液，裝入帶內襯管的液相進樣小瓶中，用于分析測定。

1.3.3 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mmh 2.1 mm，1.7 μm），柱溫45 ℃；流速0.35 mL/min；進樣量5 μL。流動相A：乙腈-水（60∶40，V/V），溶液含10 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸；流動相B：乙腈-異丙醇（10∶90，V/V），溶液含10 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸；梯度洗脫條件：0～3.0 min，70% A，30% B；3.0～5.0 min，7 0%～3 8% A，30%～62% B；5.0～15.0 m in，3 8%～8% A，62%～92% B；15.0～16.5 m in，18%～1% A，82%～99% B；16.5～18.0 min，1% A，99% B；18.0～18.1 min，1%～70% A，99%～30% B；18.1～20.0 min，70% A，30% B。

1.3.4 質譜條件

加熱電噴霧離子源（heated electrospray ionization，HESI），正離子模式，溫度350 ℃，噴霧電壓3.5 kV，離子傳輸管溫度320 ℃，鞘氣流速40 arb；輔助器流速10 arb；吹掃氣流速0 arb。負離子模式，溫度350 ℃，噴霧電壓3.1 kV，離子傳輸管溫度320 ℃，鞘氣流速40 arb；輔助器流速10 arb；吹掃氣流速10 arb。Full MS/dd MS2掃描模式：采集范圍為m/z120～1 800，正負離子同時采集；一級質譜分辨率為70 000，二級質譜分辨率為17 500。

1.4 數據處理

使用Lipid Search軟件，讀取Q Exactive LC-MS/MS導出的raw格式原始數據，讀取MSn和母離子的精確質量數；根據每個獨立樣本中的母離子和多級質譜數據，鑒定其中脂質分子結構及其正負離子的加合模式；采用面積歸一法計算各類脂質組分含量。

2 結果與分析

2.1 嗜熱鏈球菌發酵乳脂質分布情況

采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS對嗜熱鏈球菌發酵乳中脂質組分進行分析，在HESI正離子和負離子模式進行檢測，如表1所示，在嗜熱鏈球菌發酵乳中檢測到甘油酯、磷脂、鞘脂和糖脂4 類脂質物質，甘油酯包含DG和TG 2種脂質，磷脂包含CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS、LPC、LPE 9 種脂質，鞘脂包含Cer、Hex1Cer、Hex2Cer、Hex3Cer、SM 5 種脂質，糖脂包括MGMG和MGDG 2 種脂質，總共18 種脂質成分。

表1 嗜熱鏈球菌發酵乳中脂質成分構成Table 1 Composition of lipids in milk fermented by Streptococcus thermophilus

圖1 嗜熱鏈球菌發酵乳中脂質分布情況Fig.1 Distribution of peak number of lipids in milk fermented by S.thermophilus

如圖1 所示，嗜熱鏈球菌發酵乳中總共檢測到1 716 個脂質峰，其中甘油酯、磷脂、鞘脂和糖脂峰數分別為861、540、282和33（圖1a），相對含量分別為49.65%、31.14%、18.57%和1.90%（圖1b）。甘油酯中DG和TG峰數分別129和732，相對含量分別為7.44%和42.21%（圖1c）；磷脂中CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS、LPC和LPE峰數分別為40、16、131、133、45、51、95、18和11，相對含量分別為2.31%、0.92%、7.55%、7.67%、2.60%、2.94%、5.48%、1.04%和0.63%（圖1d）；鞘脂中Cer、Hex1Cer、Hex2Cer、Hex3Cer和SM峰數分別為68、71、63、5和75，相對含量分別為3.92%、4.09%、3.63%、0.29%和4.33%（圖1e）。糖脂中MGMG和MGDG峰數分別為2和31，相對含量分別為0.12%和1.79%（圖1f）。

2.2 正離子模式下嗜熱鏈球菌發酵乳脂質構成

如圖2所示，在正離子模式下檢測到嗜熱鏈球菌發酵乳中4 類（甘油酯、磷脂、鞘脂和糖脂）、15 種（DG、TG、CL、PC、PE、PG、PI、PS、LPC、LPE、Cer、Hex1Cer、Hex2Cer、SM和MGDG）、1 156 個脂質組分（圖2a）。甘油酯、磷脂、鞘脂峰數分別為861、211和81，相對含量分別為95.84%、3.08%和1.08%（圖2b），糖脂峰數僅為3，相對含量為痕量。甘油酯中DG和TG峰數分別129和732，相對含量分別為4.59%和91.25%（圖2c），TG為主要的脂質組分；磷脂中CL、PC、PE、PG、PI、PS、LPC和LPE峰數分別為1、59、74、17、15、23、13和9，其中PC、PE、PG、PI、PS、LPC相對含量分別為2.35%、0.58%、0.02%、0.03%、0.10%、0.01%，LPE和CL相對含量為痕量（＜0.005%）（圖2d）；鞘脂中Cer、Hex1Cer、Hex2Cer和SM峰數分別為14、8、18和41，相對含量分別為0.05%、0.06%、0.12%和0.84%（圖2e）。糖脂是種類和含量最低脂質組分，峰數為3，相對含量為痕量。

圖2 正離子模式下嗜熱鏈球菌發酵乳中脂質分布情況Fig.2 Distribution of lipids in milk fermented by S.thermophilus under positive ion mode

2.3 負離子模式下嗜熱鏈球菌發酵乳脂質構成

如圖3所示，在負離子模式下檢測到3 類（磷脂、鞘脂和糖脂）、15 種（CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS、LPC、LPE、Cer、Hex1Cer、Hex2Cer、Hex3Cer、SM、MGMG和MGDG）、560 個脂質組分。磷脂、鞘脂和糖脂峰數分別為329、201和30，相對含量分別為35.34%、28.15%和36.51%。磷脂中CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS、LPC和LPE峰數分別為39、16、72、59、28、36、72、5和2，相對含量分別為3.15%、0.53%、15.16%、6.74%、0.93%、3.24%、5.56%、0.01%和0.02%，其中PC為主要的脂類物質含量較高；鞘脂中Cer、Hex1Cer、Hex2Cer、Hex3Cer和SM峰數分別為54、63、45、5、34，相對含量分別為3.25%、6.84%、4.82%、0.53%和12.70%，其中SM的含量較高。糖脂相對含量為36.51%，MGMG和MGDG峰數分別為2和28，相對含量分別為31.48%和5.03%，MGMG是負離子模式下檢測到含量最高的脂質。

圖3 負離子模式下嗜熱鏈球菌發酵乳中脂質分布情況Fig.3 Distribution of lipids in milk fermented by S.thermophilus under negative ion mode

由圖2、3可知，不同脂質組分在正負離子模式下分布差別較大，甘油酯僅在正離子模式下檢測到；磷脂、鞘脂和糖脂在負離子模式下檢測到較多，但是不同種類磷脂、鞘脂和糖脂成分在正負離子模式下分布也具有一定差異，磷脂CL、PA、PC、PG、PI、PS在負離子模式下峰數較多，PE、LPC和LPE在正離子模式下峰數較多；鞘脂Cer、HexCer1、HexCer2、HexCer3在負離子模式下峰數較多，SM在正離子模式峰數較多；糖脂主要在負離子模式檢測到。可見不同脂質組分在不同離子狀態下差別較大，采用正負離子模式可以全面了解嗜熱鏈球菌發酵乳中脂質組分構成。

2.4 嗜熱鏈球菌發酵乳中脂質成分構成

UPLC-Q-Orbitrap HRMS脂質組學分析技術，具有高通量檢測的優點，檢測到脂質組分種類繁多、結構復雜，但含量較高的脂質對樣品營養和功能具有更重要貢獻，因此，本研究主要對相對含量大于10%的高脂質組分進行分析，正負離子模式下檢測到相對含量高于0.10%的脂質組分構成如表2、3所示。在正離子模式下檢測到113 種脂質成分相對含量大于0.10%，占總量的85.24%，其中TD為主，98 種TD成分相對含量大于0.10%；在負離子模式下檢測到104 種脂質成分相對含量大于0.10%，占總量的83.50%，PC、SM和MGMG等為主要脂質組分。

2.4.1 嗜熱鏈球菌發酵乳中甘油酯組構成

甘油酯主要是由TD和DG 2 種脂質構成，它們僅在正離子模式下被檢測，其中TD是最主要的脂質組分，TD主要是甘油不同位點上的羥基被脂肪酸酯化形成的，由于在甘油不同位點上的脂肪酸的碳數、雙鍵數、雙鍵位置和構象等的差別，使得TD的數目龐大、結構復雜[14]。由表2 可知，T D 組分中有2 1 種成分相對含量大于1%，其中TG（16∶0/6∶0/14∶0）、TG（4∶0/14∶0/16∶1）、TG（10∶0/10∶0/12∶0）、TG（4∶0/10∶0/14∶0）、TG（4∶0/17∶0/18∶0）、TG（6∶0/10∶0/18∶2）、TG（16∶1/14∶1/18∶1）7 種TD含量較高，分別占16.32%、7.79%、6.64%、4.18%、3.16%、2.69%和2.60%。在表1所示的TD脂肪酸中，主要由C4～C18的雙鏈脂肪酸構成，其脂肪酸構成和牛乳中脂肪酸構成一致[15-16]，TD主要是牛乳脂肪酸和甘油在乳腺中相關基因和蛋白作用下合成[17]。TD是牛乳中主要脂質組分，是人體的重要能量來源，其結構差別對牛乳脂肪理化特性、乳制品質量以及人體消化吸收率都有重要影響[18-20]。張宏達等[8]采用UPLC-QTOF-MS對牛乳脂質組分進行分析，也發現TG為牛乳中主要脂質組分，但發現，TG（18∶1/18∶2/18∶2）、TG（16∶0/18∶1/18∶2）和TG（16∶0/18∶0/18∶1）為牛乳中主要TD，以C16～C18鏈長脂肪酸為主，與本研究發酵乳TD中C4～C18脂肪酸構成有一定差異，可能與牛乳來源、品種以及發酵等因素有關。陳鳳香等[21]認為，牛乳TD成分中，高、中和低分子質量脂肪酸組分所占的比例為40%、20%和40%，在一定程度上和本研究結果較為一致。DG是甘油中2 個羥基與脂肪酸酯化后得到的脂質，是牛乳中微量成分及體內脂肪代謝的內源中間產物，在檢測到的DG中，僅有5 種成分相對含量大于0.10%，其中僅DG（34∶2e）的相對含量為2.79%，是含量較高的DG組分。DG是不同乳制品中廣泛存在的脂質組分，在降低餐后脂質水平和促進人體中脂肪氧化具有積極作用，在減肥和肥胖治療具有廣泛應用前景[22-23]。

表2 正離子模式下嗜熱鏈球菌發酵乳脂質組分構成（n＝3）Table 2 Composition of lipids in milk fermented by S.thermophilus under positive ion mode (n= 3)

續表2

表3 負離子模式下嗜熱鏈球菌發酵乳脂質組分構成（n＝3）Table 3 Composition of lipids in milk fermented by S.thermophilus under negative ion mode (n= 3)

續表3

2.4.2 嗜熱鏈球菌發酵乳中磷脂構成

磷脂為甘油的第3個羥基被磷酸酯化的脂質，是生物膜的重要組成成分，還是膜表面活性物質成分之一，參與細胞膜對蛋白質的識別和信號傳導[24]。由表2、3可知，磷脂是能夠在正、負離子模式下檢測到的脂質，嗜熱鏈球菌發酵乳中磷脂成分為CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS、LPC和LPE，是生物體內常見的磷脂成分，其中CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS在負離子模式下檢測到的數量較高，而LPC和LPE則在正離子模式下檢測到的數量較高。在正離子模式下僅有7 種CL和1 種PE的磷脂成分相對含量高于0.10%；而在負離子模式下分別有3 種CL、14 種PC、15 種PE、2 種PG、6 種PI和13 種PS成分相對含量大于0.10%，在這些成分中，CL（70∶2）、PC（16∶0/14∶0）、PC（18∶1/18∶1）、PC（18∶0/16∶0）和PC（18∶0/18∶1）相對含量分別為1.37%、3.60%、2.03%、1.93%和2.61%，是主要的磷脂成分，主要由C14～C18脂肪酸構成。PC（16∶0/14∶0）、PC（18∶0/16∶0）、PC（18∶0/18∶1）3 種PC組分被鑒定為母乳、豆乳和牛乳中差異性脂質組分，用于區別3 種乳品[12]，另外，PC（18∶1/18∶1）和PC（18∶0/18∶1）被鑒定為驢初乳和驢乳中差異性脂質組分，用于驢乳產品開發探索[13]，可見這幾種PC成分可能是乳品中廣泛存在的磷脂成分。磷脂被認為是抗結腸癌、胃腸道病原體、阿爾茨海默氏病、抑郁和壓力的功能成分，具有兩親性質，使其適合添加到各種食品基質中[25-27]。因此，大量磷脂成分在樣品中檢出，對于嗜熱鏈球菌發酵乳營養功能挖掘以及加工適應性改善可能有重要幫助。

2.4.3 嗜熱鏈球菌發酵乳中鞘脂構成

鞘脂主要是一類以鞘氨醇為骨架的復雜化合物，鞘脂由脂肪酸、鞘氨醇和磷酸膽堿三部分組成，分為鞘磷脂、鞘糖脂和神經酰胺。存在于天然食物中，主要位于細胞糖膜、脂蛋白和其他富含脂類的組織結構上，對于維持細胞膜結構尤其是細胞膜的微控功能十分重要[28]。由表2、3可知，鞘脂也是一類能夠在正、負離子模式下檢測到的脂質組分，嗜熱鏈球菌發酵乳中鞘脂為Cer、Hex1Cer、Hex2Cer、Hex3Cer和SM，在正離子模式下，僅2 種SM成分相對含量大于0.10%，在負離子模式下，分別檢測到5 種Cer、11 種Hex1Cer、10 種Hex2Cer和16 種SM的甘油磷脂成分相對含量大于0.10%，在這些鞘脂中，除了Cer中脂肪酸碳鏈為C16～C24，其他的脂肪酸鏈長多數在C30以上。所檢測到的鞘脂中，SM（d38∶0）、SM（d39∶1）、SM（d40∶0）相對含量較高，分別為1.24%、4.20%和1.20%，是主要的鞘脂成分。鞘脂已經在牛乳、驢乳等不同來源乳品中檢測到，鞘脂具有抗癌、抑菌和低膽固醇等生物特性[29-30]，在乳品開發利用中具有重要營養價值。

2.4.4 嗜熱鏈球菌發酵乳中糖脂構成

糖脂是糖和脂質結合所形成物質總稱，在生物體中分布甚廣，但含量較少，僅占脂質總量的小部分。樣品中糖脂為糖基酰基甘油，其結構與磷脂相類似，主鏈是甘油，含有脂肪酸，但不含磷及膽堿等化合物。糖類殘基是通過糖苷鍵連接在1,2-甘油二酯的C-3位上構成糖基甘油酯分子[31]。由表2、3可知，糖脂也能被正負離子檢測到，但相對含量大于0.10%的糖脂成分僅在負離子模式下被檢測到，有6 種MGDG 和1 種MGMG相對含量高于0.10%，MGDG（18∶1/20∶4）、MGMG（2∶0）相對含量較高分別為1.77%和32.49%，其中MGDG是負離子模式下主要的脂質組分。目前，采用脂質組學技術在乳中檢測到糖脂成分報道相對較少，研究表明，糖脂在抗腫瘤、抗HIV、抗炎癥、抗菌和增強機體免疫等方面具有生物活性[32]，本研究糖脂的發現對于全面了解乳及乳制品脂質構成，深入挖掘乳品生物活性具有重要意義。

3 結 論

采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術具有高通量、高靈敏度、高準確度，可有效對嗜熱熱鏈球菌發酵乳中脂質的組分構成和分子結構進行全面分析，在HESI正離子和負離子模式下，共檢測到1 716 個脂質組分，包含甘油酯（DG、TG）、磷脂（CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS、LPC、LPE）、鞘脂（Cer、Hex1Cer、Hex2Cer、Hex3Cer、SM）和糖脂（MGMG、MGDG）4 類18 種脂質組分。在HESI正離子模式下，甘油酯、磷脂、鞘脂相對含量分別為95.84%、3.08%、1.08%，TG（16∶0/6∶0/14∶0）、TG（4∶0/14∶0/16∶1）、TG（10∶0/10∶0/12∶0）為主要脂質成分為主要脂質物質。在HESI負離子模式下，磷脂、鞘脂和糖脂的相對含量分別為35.34%、28.15%和36.51%，MGMG（2∶0）為主要脂質物質。基于脂質組學對嗜熱鏈球菌發酵酸乳脂質組分構成的研究，對于全面解析嗜熱鏈球菌發酵乳脂質構成、挖掘發酵乳的營養和功能特性具有積極指導意義，也可為嗜熱鏈球菌的利用以及新型乳品的開發提供參考。目前，本研究只對嗜熱鏈球菌發酵乳中脂質組分構成進行分析，尚未對發酵前后發酵乳中脂質組分差異以及脂質代謝相關酶活性變化進行研究，因此，今后需要對此進行深入研究，以期為嗜熱鏈球菌發酵乳脂質品質形成提供理論依據。