核磁共振磷譜法測定乳制品中的酪蛋白含量

馮翠萍，劉一諾，樊雙喜，武竹英，鐘其頂,3,*

（1.中國食品發酵工業研究院有限公司，北京 100015；2.全國食品發酵標準化中心，北京 100015；3.國家食品質量監督檢驗中心，北京 100015）

核磁共振磷譜（31P nuclear magnetic resonance，31P NMR）從1985年就開始應用于食品領域，現已在食品中有廣泛的應用[1-8]。31P NMR靈敏度約為氫譜的6.64%，是碳譜的377 倍，化學位移范圍很寬，且無四極矩效應，因此有很好的靈敏度和分辨率，用于定量分析有較大的優勢。酪蛋白是乳品中主要的蛋白組分，主要包括αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，都是含磷的蛋白質[9-10]，所以可用31P NMR進行檢測。

酪蛋白進入機體后在胰蛋白酶等作用下，水解成酪蛋白磷酸肽，研究表明酪蛋白磷酸肽具有促進小腸對礦物質尤其是鈣的吸收，促進牙齒、骨骼中鈣的沉淀和鈣化及增強機體免疫力等功效[10-13]。酪蛋白是牛奶及其他乳制品中最主要的蛋白質，牛奶中的酪蛋白約占蛋白總量的80%～90%。酪蛋白含量是衡量牛奶及其他乳制品營養價值的一個重要指標[14]。部分乳制品生產廠家為降低成本，用明膠、乳清粉、大豆分離蛋白等代替乳蛋白，因此僅測定總蛋白質含量，不能檢出是否摻假。酪蛋白作為牛乳中的一種特征蛋白質，其質量分數約為2.6%，很少受到季節、飼料等因素的影響。所以檢測酪蛋白的含量可作為判定乳制品中經濟摻假行為的重要指標[14]，因此，亟需建立一種快速且準確性高的定量檢測乳制品中酪蛋白的方法。

目前我國GB 31638ü 2016《酪蛋白》中已提出酪蛋白的指標，并在附錄A中指定了測定方法，即常規測定乳制品中酪蛋白的方法[15-17]，先用等電沉淀法提取乳制品中的酪蛋白，再用GB 5009.5ü 2016《食品中蛋白質的測定》第一法或第二法測定。提取酪蛋白的過程步驟較多，用時較長，不確定的因素多，所以誤差較大。蛋白質的測定方法中第一法或第二法也各有其缺點，第一法凱氏定氮法，靈敏度低，用時長（8～10 h），含氮的其他物質對測定會造成干擾，如三聚氰胺事件。第二法分光光度法，嘌吟和嘧啶及各種核苷酸對檢測會造成干擾，干擾物質多，準確度也較差。對于高溫消毒的牛奶，因加熱的過程中乳清蛋白可能和酪蛋白產生共價鍵連接，用常規方法會造成測定結果偏大。有相關研究報道采用納米材料BSPOTPE測定奶粉中酪蛋白的含量[18]，這種方法依賴于BSPOTPE納米材料，且樣品中和酪蛋白分子大小相似的物質，如脂肪會對測定造成干擾。也有報道用同位素稀釋質譜法測嬰幼兒配方奶粉及牛乳、乳粉為原料的飲料中酪蛋白的含量[19-20]，但仍需用等電沉淀法提取酪蛋白，再加入多肽同位素內標和胰蛋白酶進行酶解16 h，用高效液相色譜-質譜聯用法進行定量分析，檢測所需時間長，步驟繁瑣。酶聯免疫法[21]同樣需要首先提取酪蛋白，再依賴特異性的抗體實現檢測，且屬于半定量的檢測方法。聚合酶鏈式反應技術[22]需要獲取相關的基因片段、昂貴的設備和專業人才，應用有一定的限制；毛細管電泳法[23]準確性不夠高，也不能廣泛應用于各類乳品的檢測。所以還沒有一種簡單快速且準確性高的定量檢測乳制品中酪蛋白的方法。

基于以上問題將31P NMR用于測定乳制品中酪蛋白的含量，旨在建立一種快速、準確、實用的酪蛋白定量檢測方法。相比于現有酪蛋白測定方法，前處理簡單快速，高溫滅菌等處理也不會對測定結果造成影響，測定的干擾因素少，準確性高。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白標準品（C5890） 美國Sigma-Aldrich公司；亞甲二膦酸（≥98%） Aladdin試劑（上海）有限公司；二水合乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA，≥99%）、疊氮化鈉（高純）北京博奧拓達科技有限公司；重水（D2O，99.9%）青島騰龍微波科技有限公司；氫氧化鈉（分析純）北京化工廠；水為GB/T 6682ü 2008《分析實驗室用水規格和試驗方法》規定的一級水；不同品牌的各類乳制品購于北京某大型超市。

1.2 儀器與設備

Avance III HD 400M波譜儀（配備BBO探頭、SampleJet自動進樣器、SampleJet 5 mm高通量核磁管、pH計） 德國Bruker Biospin公司；MX-S渦旋混合器大龍興創實驗儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 EDTA溶液配制

準確稱取1.86 g EDTA溶于8 mL水中，在渦旋混合器上充分混合，用1 mol/L的NaOH溶液調節溶液pH值至8.0，使EDTA充分溶解于水中，再加入1 mg疊氮化鈉，充分搖勻，然后轉移至10 mL容量瓶，用D2O定容至10 mL。

1.3.2 亞甲二磷酸溶液配制

準確稱取0.352 g亞甲二磷酸，用渦旋混合器充分溶解于8 mL水中，完全轉移至10 mL容量瓶中，定容至10 mL。

1.3.3 酪蛋白標準品溶液配制

準確稱取5.00 mg酪蛋白標準品，溶于800 μL去離子水中，再加入10 μL 200 mmol/L的亞甲二磷酸、100 μL 0.5 mol/L EDTA，充分搖勻，用1 mol/L的NaOH-D2O溶液調pH值為9.5，再用氘水稀釋至1 mL，得到質量濃度為5.00 g/L的酪蛋白標準溶液，取600 μL于核磁管中測定；用同樣的方法配制10.00、15.00、20.00、25.00、30.00、35.00 g/L的酪蛋白標準品溶液，并分別取600 μL于核磁管中測定。

1.3.4 樣品的制備

1.3.4.1 液體奶樣品制備

準確吸取800 μL液體奶，加入10 μL 200 mmol/L的亞甲二磷酸溶液，100 μL 0.5 mol/L EDTA，充分搖勻。再用1 mol/L的NaOH-D2O溶液調pH值為9.5，再用氘水稀釋至1 mL。8 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄去上層脂肪，取600 μL于核磁管中測定。對于高鈣液體奶，先用水稀釋，再配制，稀釋的比例為液體奶和水的體積比為3∶1。

1.3.4.2 奶粉樣品制備

稱取200 mg奶粉樣品溶于1 mL水中，充分搖勻。以下步驟同液體奶樣品配制。

1.3.4.3 酸奶樣品制備

準確稱取5 g酸奶，用1 mol/L NaOH溶液調pH值為9.5，然后準確稱量調完pH值的酸奶質量。以下步驟同液體奶樣品配制。

1.3.4.4 奶片樣品制備

將奶片研磨成粉末，稱取200 mg奶片粉末樣品溶于1 mL水中，充分搖勻。以下步驟同液體奶樣品配制。

1.3.531P NMR上機測試參數

采用BBO探頭，31P的共振頻率為161.97 MHz，Bruker Top Spin 3.5軟件用于31P NMR譜圖數據的采集；掃描次數1 700；譜寬5 000 Hz；中心頻率106；弛豫延遲時間2 s；采樣時間1.6 s；檢測溫度300 K；布魯克的標準脈沖序列zgig30；檢測核為31P。

1.3.6 精密度分析

選取一個樣品溶液，同一天內連續測定5 次，取平均值，分析方法的日內精密度；連續測定5 d，每天測定5 次取平均值，分析方法的日間精密度。

1.3.7 回收率實驗

配制樣品20 份，其中5 份作為對照組，其余15 份由低至高，分別添加5.00、10.00、15.00 g/L 3 個不同質量濃度水平的酪蛋白標準品，在1.3.5節的條件下測定其31P NMR，計算回收率和相對標準偏差。

1.3.8 方法對比

將31P NMR定量檢測乳品中酪蛋白的方法與食品安全國家標準GB 31638ü 2016附錄A中指定的酪蛋白測定方法用于檢測同一批樣品，對檢測結果進行對比分析，驗證檢測方法的準確性。

1.4 數據處理

采用MestReNova 12.0軟件（Mestrelab Research S.L.，MestReNova（Mnova）NMR，USA）對31P NMR譜圖進行傅里葉變換、基線矯正、相位調整。線寬因子為3。相位校正選擇metabonomics算法，先自動優化，后針對特定區域進行手動校正，使盡可能多的積分值為正值。基線校正選擇polynomial fit擬合方式。

2 結果與分析

2.1 乳制品中酪蛋白含量31P NMR譜定量方法選擇

在乳制品中磷以多種形式存在，包括在乳清蛋白和酪蛋白膠束中和鈣結合的無機磷，以及與酪蛋白、脂類和碳水化合物等分子以共價結合的有機磷。在31P NMR中，乳制品中和酪蛋白以共價鍵結合的磷酸酯和其他形式存在的磷能夠很好地分離[24-25]。向乳制品中加入EDTA消除鈣離子干擾的前提下，將樣品的pH值調至堿性，不同的酪蛋白可在同一個位置出峰，為定量提供了便利[24,26]。

由于乳制品中的酪蛋白是混合物，不能用常規的內標法或外標法定量，所以采用酪蛋白標準品制作標準曲線，再用插值法得到牛奶中酪蛋白含量，具體步驟如下：首先測定加入固定量內標物質的酪蛋白標準品的磷譜，將酪蛋白標準品和內標物質積分面積比值作橫坐標，酪蛋白標準品濃度作縱坐標，得到線性回歸方程y=ɑx+β，再用相同條件測定用相同方法制備的乳制品樣品的磷譜，得到樣品中酪蛋白和二甲基磷酸積分面積比值，用插值法得到乳制品樣品中酪蛋白的含量。

也可以選擇不用內標物質，將酪蛋白標準品積分面積的絕對值作橫坐標，酪蛋白標準品濃度作縱坐標，得到線性回歸方程y=ɑx+β，再用相同方法得到樣品中酪蛋白的絕對積分面積，用差值法得到樣品中酪蛋白的含量。如果不用內標物質，對于內標物和樣品測試參數和處理參數必須完全一致，如線寬因子、傅里葉變換點數、基線矯正方法、積分方法、積分范圍等。為降低測試及譜圖處理等因素對結果造成影響，選擇使用內標物質的方法。

2.2 標準品選擇

牛乳制品中酪蛋白含量會隨著季節等因素有較小幅度的改變，但酪蛋白中磷含量穩定[17]。不同種類乳制品，酪蛋白中磷含量會有差別[27]，如測定羊乳制品中的酪蛋白含量，應選用相對應的酪蛋白標品作標準曲線，否則會對定量結果的準確性造成影響。

2.3 內標物質、定量峰、積分區域選擇

內標物質應滿足一般核磁定量測試對內標物質的要求，即內標物質不與待測樣品反應，能溶于待測樣品，內標物質信號不和待測樣品中信號重疊，且內標物質信號峰和待測物質定量信號峰位移相差不應太大。亞甲二磷酸可溶于牛奶，其磷譜信號不和牛奶中各種磷信號重疊，且和酪蛋白的位移值相差較小，因此選用亞甲二磷酸作為內標物質。

由圖1可知，當內標亞甲二磷酸信號位移定為δ16.13時，δ3.89處的多峰為酪蛋白定量峰，亞甲二磷酸積分區域為δ16.75～15.60，酪蛋白積分區域為δ4.41～3.45。

圖1 乳制品樣品的31P NMR譜圖Fig.1 31P NMR spectrum of dairy sample

2.4 檢測參數優化

按照常規的核磁定量方法，為保證定量準確，弛豫延遲時間應大于5 倍的縱向弛豫時間，使得信號得到完全弛豫。根據文獻[28]可知，與酪蛋白結合的磷酸酯的31P NMR縱向弛豫時間為2 s，亞甲二磷酸31P NMR的縱向弛豫時間為6 s，所以弛豫延遲時間至少應為30 s，樣品檢測時間太長。采用先作標準曲線，再用插值法得到樣品中酪蛋白含量時，不需要保證測試過程中磷的信號完全弛豫，只需保證相同的測試時間，定量信號有較高的信噪比（RSN），標準曲線有較好的線性。

測試時間均為1.7 h，弛豫延遲時間在0.5～16 s分別測試得到譜圖（圖2）。弛豫延遲時間從0.5 s降至2 s，RSN相差較小，弛豫延遲時間不小于4 s時，RSN逐漸降低。按照1.3.3節的方法配制酪蛋白標準品溶液，弛豫延遲時間分別為0.5 、1 、2 s，采樣次數分別為2 900、2 350、1 700，使得測試時間均為1.7 h，1.3.5節中其他測試參數不變測試得到譜圖，以酪蛋白定量峰的積分面積和內標物定量峰的積分面積比值作橫坐標，酪蛋白的濃度作縱坐標，得到線性回歸方程，相關系數R2分別為0.958 8、0.960 0、0.999 6，可見弛豫延遲時間為2 s時有較好的RSN和線性，所以本實驗采用弛豫延遲時間為2 s，采樣次數為1 700。

圖2 相同測試時間時不同弛豫時間得到的酪蛋白NMR譜圖Fig.2 NMR spectra of casein obtained with different relaxation times at the same test time

2.5 方法學考察結果

2.5.1 線性關系

以酪蛋白積分面積和內標物積分面積比值作橫坐標，酪蛋白質量濃度作縱坐標，得到線性回歸方程y=18.439x+0.069，R2=0.999 6，可見線性關系良好。

2.5.2 精密度分析

用同奶粉樣品相同的方法對液體奶、酸奶、奶片樣品進行日內精密度和日間精密度分析。如表1所示，奶粉樣品的日內精密度和日間精密度相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為0.65%和1.40%；液體奶樣品的日內精密度和日間精密度RSD分別為0.87%和1.62%；酸奶樣品的日內精密度和日間精密度RSD分別為0.90%和1.75%；奶片的日內精密度和日間精密度RSD分別為1.4%和1.80%。日內與日間兩者酪蛋白測定結果均無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 精密度實驗結果（n=5）Table 1 Precisions of the method (n= 5)

2.5.3 回收率實驗

將液體奶和酸奶用水稀釋1 倍，奶片研磨成粉末，均用與奶粉樣品相同的方法做回收率實驗。如表2所示，該方法的回收率在91.94%～105.10%范圍區間，回收率的RSD在0.87%～1.50%范圍區間，可見奶粉、液體奶、酸奶、奶片中酪蛋白檢測方法精確度較好，能夠滿足酪蛋白含量準確測定要求。

表2 方法回收率實驗結果（n=5）Table 2 Recovery of spiked samples (n= 5)

2.5.4 檢出限與定量限

將酪蛋白標準品譜圖RSN為3時的質量濃度作為檢出限，酪蛋白標準譜圖RSN為10時的質量濃度作為定量限[19,29]。在1.3.5節及1.3.6節的測試參數及數據處理條件下，檢測限為0.38 g/L，定量限為1.25 g/L。

2.5.5 方法準確性分析

將以上建立的31P NMR定量檢測乳制品中酪蛋白的方法和GB 31638ü 2016附錄A中指定的酪蛋白測定方法分別用于檢測同一批11 個樣品，每個樣品重復測定2 次，取平均值，對檢測結果進行對比分析，結果如表3所示，其中編號為8和9的樣品為酸奶樣品，樣品本身的pH值低于酪蛋白的等電點，不適用于國標法測定。以國標法測定結果為橫坐標，以31P NMR定量結果為縱坐標作線性回歸，相關系數R2為0.999 9，國標法和31P NMR定量結果誤差在±5%以內，滿足方法可行性對比分析驗證要求。研究表明31P NMR定量法可以用于對乳品中酪蛋白的準確測定，且更具有廣泛的適用性。

表3 31P NMR定量法與國標法測定乳制品中酪蛋白含量比較Table 3 Comparison of casein contents in dairy products determined by the 31P NMR method and the national standard method

3 結 論

本實驗建立了一種采用31P NMR技術對乳制品中酪蛋白定量的方法，對于現有測試條件該方法的檢出限為0.38 g/L（RSN=3），定量限為1.25 g/L（RSN=10），具有較高的靈敏度，完全滿足一般乳品中酪蛋白的檢測需求。在5.00～35.00 g/L質量濃度范圍內線性良好，相關系數R2大于0.999；加標回收率在91.94%～105.10%范圍區間；日內精密度在0.65%～1.40%范圍區間；日間精密度在1.40%～1.80%范圍區間。31P NMR與GB 31638ü 2016測定結果誤差在±5%以內，測定結果準確。該方法相比GB 31638ü 2016方法，樣品用量少，前處理操作簡便，對于市售的一般奶粉和液體奶樣品檢測單個樣品的時間為1.7 h左右，如果儀器靈敏度提高或用容積大的10 mm核磁樣品管，檢測時間可以更短。在確保重復性、測定結果準確性的基礎上，該方法極大的節約了時間與人力，大批量樣品檢測時成本較低，同時適用于對pH值低于酪蛋白等電點的酸奶樣品中酪蛋白的檢測，可廣泛應用于相關檢測機構以及企業日常檢驗、生產指導、出廠檢驗等方面。