沙棘多糖分離純化及抗氧化活性

魏晨業，包曉瑋，王 娟，何夢夢，曾蘭君，張亞濤

（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

沙棘（Hippophae rhamnoides）為落葉灌木或小喬木，屬胡頹子科（Elaeagnaceae）[1]，不僅能夠防風固沙，還富含蛋白質[2]、多糖[3]、維生素[4]、胡蘿卜素、黃酮[5]、碳水化合物、有機酸、氨基酸[6]和礦物質等[7]營養成分和藥用成分，其不同部位，尤其是漿果，被認為是新疆、內蒙古和西藏的傳統藥物，具有多種活性，如抗菌、抗氧化和抗衰老作用[8]。沙棘多糖（sea buckthorn polysaccharides，SBP）在醫藥方面，具有抗腫瘤，預防心、腦血管系統[9]疾病等作用。多糖是在動物細胞膜、高等植物和微生物細胞壁[10]中發現的天然聚合物，無毒[11]、副作用小、生物活性廣泛，是天然存在的重復單元（單糖或雙寡糖）聚合碳水化合物，通過糖苷鍵連接在一起，是生命活動中必不可少的生物大分子，具有免疫調節[12]、抗腫瘤[13]、抗氧化等功能，在功能和醫學領域得到了廣泛的研究。

氧化對于生物體內能量的產生具有重要的意義，活性氧，例如羥自由基、過氧化氫和超氧陰離子自由基，可以通過多種方式在生物體中產生。在正常生理條件下，產生少量自由基是有益的。然而，過量的活性氧會產生氧化應激和可能引起多種疾病，還有可能會威脅到人類的健康[14]。目前，大多數合成抗氧化劑對人體都有潛在的危害[15]，尋找天然抗氧化劑而不是合成抗氧化劑顯得尤為重要。

本實驗通過對沙棘進行提取、分離純化得到SBP，并對其單糖組分、結構表征及抗氧化活性進行分析，旨在為SBP的開發和應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘產自新疆阿勒泰；纖維素柱D E A E-5 2北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS） 美國Sigma公司；三氟乙酸等其他試劑為分析純；單糖標準品：核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖（均為色譜純） 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

KQ-250DE超聲波處理器 濟寧金百特電子有限責任公司；7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司；FDU-2100冷凍干燥機 日本Eyela公司；RE-52AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Nicolet iS50型紅外光譜儀 賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 沙棘粗多糖的制備

根據課題組研究的方法進行[16]。將200 g沙棘干果粉碎，過40 目篩，加入10 倍體積石油醚回流提取2 次，每次1 h，待除去其中的脂溶性物質，抽濾，留濾渣待用。準確稱取預處理后的沙棘果渣適量，按料液比1∶20（g/mL）加入蒸餾水，70 ℃超聲波輔助提取，提取液濃縮至一定體積，加入3 倍體積無水乙醇，4 ℃靜置12 h使沉淀產生，沉淀離心，用Sevag法[17]除蛋白共5 次，置40 ℃烘箱干燥即得沙棘粗多糖。

1.3.2 SBP的分離純化

稱取100 mg沙棘粗多糖樣品，溶于10 mL蒸餾水中，配制成質量濃度為10 mg/mL的多糖溶液，7 000 r/min離心10 min去除不溶性物質，將離心后的多糖溶液過0.45 μm過濾膜，加樣至DEAE-52纖維素柱[18]，用蒸餾水、0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫，每個梯度洗脫200 min，自動收集器收集（流速為0.6 mL/min，每管收集9 mL），蒽酮-硫酸法[19]檢測多糖，合并主要吸收峰洗脫液，氯化鈉洗脫部分透析48 h除鹽，濃縮冷凍干燥。

1.3.3 SBP單糖組成測定

1.3.3.1 標準單糖的衍生化

分別準確稱取5 mg各標準單糖，包括核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖，放入試管中。分別加入8 mg鹽酸羥胺及0.5 mL吡啶，溶解后置于90 ℃水浴中，使其反應30 min。取出后，冷卻至室溫。接著加入0.5 mL乙酸酐，再置于90 ℃水浴加熱[20]，反應30 min，氮吹儀吹干，加入1.0 mL氯仿，產物用于氣相色譜-質譜聯用分析。

1.3.3.2 SBP樣品的水解及衍生化

準確稱取5 mg多糖純品，溶解于4 mL 2 mol/L三氟乙酸中，置于安瓿瓶，酒精噴燈封管。鼓風干燥箱中于110 ℃密閉水解反應6 h。反應結束，酸水解的樣品中加入5 mL甲醇，旋蒸蒸干，重復3 次，除掉剩余的三氟乙酸。按1.3.3.1節標準單糖衍生化方法處理，反應產物進行氣相色譜分析。

1.3.3.3 氣相色譜條件

毛細管色譜柱OV-1701（30 cmh 0.32 mm，0.25 μm）；火焰離子化檢測器，檢測器溫度270 ℃；進樣口溫度250 ℃。色譜柱采用程序升溫，起始溫度160 ℃，保留5 min，以5 ℃/min速率升至190 ℃，保留5 min，再以5 ℃/min速率升至230 ℃，保留5 min。以氮氣為載氣[21]，進樣體積1 μL。

1.3.4 SBP紅外光譜的測定

稱取多糖樣品各1.5 mg[22]與適量KBr粉末置于瑪瑙研缽中研磨，研磨至極細粉末后壓片。在4 000～400 cm-1范圍內進行紅外光譜掃描。

1.3.5 SBP抗氧化活性分析

1.3.5.1 DPPH自由基清除活性測定

根據馮炘等[23]的方法稍作修改。取不同質量濃度SBP及VC溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）各1 mL，分別加入2 mL 0.2 mol/L DPPH自由基的乙醇溶液，混合均勻，在室溫避光靜置30 min，在波長517 nm處測定吸光度，以VC為陽性對照，清除率按式（1）進行計算：

式中：A1為待測樣DPPH自由基的乙醇溶液；A2為待測樣+無水乙醇；A0為無水乙醇+DPPH自由基的乙醇溶液。

1.3.5.2 ABTS陽離子自由基清除活性測定

根據劉宇琪等[24]的方法稍作修改。配制不同質量濃度的SBP溶液各取1 mL，加入4 mL ABTS工作液，完全混合，暗處反應6 min，734 nm波長處測定吸光度，以VC為陽性對照，按式（2）計算其清除率：

式中：A1為試樣與ABTS混合溶液吸光度；A為不含ABTS樣品溶液吸光度；A0為取代樣品溶液的蒸餾水的吸光度。

1.3.5.3 還原能力的測定

根據張瑞娟等[25]的方法稍作改進。配制不同質量濃度的SBP溶液，取1 mL，加入0.2 mol/L的PBS（pH 6.6）2 mL，質量分數1%的鐵氰化鉀溶液2 mL，均勻混合后，在50 ℃水浴中反應20 min，加入10%三氟乙酸溶液2 mL，3 000 r/min離心10 min。取離心后上層液50 μL，加2 000 μL蒸餾水與1%六水氯化鐵200 μL，搖勻，反應10 min。蒸餾水作為空白對照，VC作為陽性對照，在700 nm[26]波長處測定吸光度。

2 結果與分析

2.1 SBP DEAE-52纖維素柱純化結果

圖1 DEAE-52纖維素柱洗脫結果Fig.1 Elution curve of crude polysaccharides on DEAE-52 cellulose column

如圖1所示，SBP通過DEAE-52層析柱分離，得到3 個明顯的洗脫峰，分別是以蒸餾水、0.2、0.4 mol/L NaCl溶液洗脫得到。在用蒸餾水洗脫時，一些不帶電或帶電能力弱的組分[27]，不易被DEAE-52纖維素吸附，因此首先被洗脫出即得到第1個組分SBP-I。從洗脫曲線還可看出，NaCl溶液中的Cl-吸附性強，可將被DEAE-52纖維素吸附的有負電荷的部分洗脫下來，即得到由0.2、0.4 mol/L NaCl溶液洗脫的SBP-II和SBP-III組分。

2.2 紅外光譜分析

圖2 SBP-I（A）、SBP-II（B）、SBP-III（C）紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of SBP-I (A), SBP-II (B) and SBP-III (C)

如圖2所示，在4 000～400 cm-1[28]范圍內3 種組分均出現了典型的多糖吸收峰。3 420 cm-1左右的寬峰為Oü H的伸縮振動峰；2 920 cm-1附近的吸收峰為Cü H伸縮振動峰[29]；1 620 cm-1左右的吸收峰是多糖水合振動峰；1 400 cm-1左右是Cü H面內彎曲振動信號峰；1 000～1 200 cm-1之間3 個弱吸收峰是Cü O鍵伸縮振動吸收峰Cü Oü H的彎曲振動峰；835 cm-1附近的吸收峰是α-糖苷的特征峰；880 cm-1附近的吸收峰為β-糖苷的特征峰[30]，可推斷SBP-I及SBP-II屬于α-構型的多糖；SBP-III屬于β-構型的多糖。

2.3 氣相色譜分析

利用糖腈乙酸酯衍生化方法處理樣品，根據氣相色譜的定性分析，測定3 種多糖組分的單糖組成。所設定條件下測得的混合標準品及樣品的乙酰化衍生物色譜圖如圖3、4所示。SBP-I單糖組成主要有阿拉伯糖（3.11%）、木糖（2.63%）、甘露糖（5.78%）、葡萄糖（84.65%）及半乳糖（3.81%），物質的量比為阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=1.18∶1∶2.20∶32.17∶1.45；SBP-II單糖組成主要有木糖（40%）、甘露糖（11.2%）、葡萄糖（40.8%）及半乳糖（8.0%），物質的量比為木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=1∶0.28∶1.02∶0.20；SBP-III單糖組成主要有木糖（29.15%）、葡萄糖（62.68%）及半乳糖（8.16%），物質的量比為木糖∶葡萄糖∶半乳糖=1∶2.15∶0.28。

圖3 單糖標準品氣相色譜圖Fig.3 GC chromatogram of mixed standard monosaccharides

圖4 SBP-I（A）、SBP-II（B）、SBP-III（C）的氣相色譜圖Fig.4 GC chromatograms of SBP-I (A), SBP-II (B) and SBP-III (C)

2.4 SBP體外抗氧化活性結果

2.4.1 DPPH自由基清除活性

圖5 SBP-I、SBP-II、SBP-III及粗多糖對DPPH自由基的清除能力Fig.5 DPPH radical scavenging activities of SBP-I, SBP-II, SBP-III and crude polysaccharides

如圖5所示，SBP-I、SBP-II、SBP-III對DPPH自由基的清除能力隨質量濃度增加而逐漸升高，SBP-III對自由基清除力略高于其他2 種多糖，當質量濃度達到1 mg/mL時，SBP-III和SBP-II的清除率達到85.19%左右，SBP-I的自由基清除能力在一定質量濃度范圍內有小幅度升高，清除率最高為76.21%，但3 種多糖自由基清除能力均小于VC。多糖的抗氧化活性可能與單糖組分、分子大小、結構和構象有關[31]。多糖中的單糖是還原劑，因為它們可以提供氫，氫可以與自由基結合，形成穩定的DPPH-H終止自由基反應。上述結果中的SBP-I、SBPII、SBP-III可能作為供氫劑，與DPPH自由基反應生成更穩定的產物，從而清除DPPH自由基，推測純化后的多糖可能是清除自由基的主要成分，而粗多糖由于其中含有的復雜成分[32]，使得供氫能力減弱，與DPPH自由基結合較少，影響了其抗氧化活性，確切原因尚待進一步研究。

2.4.2 ABTS陽離子自由基清除活性

圖6 SBP-I、SBP-II、SBP-III及粗多糖對ABTS陽離子自由基的清除能力Fig.6 ABTS cation radical scavenging activities of SBP-I, SBP-II,SBP-III and crude polysaccharides

本實驗基于抗氧化劑通過H原子轉移的自由基猝滅或通過單電子轉移的還原對穩定ABTS陽離子自由基產生清除能力[33]。如圖6所示，粗多糖及3 種純化組分均對ABTS陽離子自由基具有一定的清除能力，且各組分的清除能力均呈現出質量濃度依賴性，當質量濃度達到0.8 mg/mL時，SBP-II、SBP-III的清除率分別為94.3%和95.52%，SBP-I為86.98%，即SBP-III對ABTS陽離子自由基的清除能力最好，其次是SBP-II，SBP-I的清除能力最弱。粗多糖對ABTS陽離子自由基清除率隨質量濃度的增大而不斷增加，且當質量濃度在0.4～0.6 mg/mL時，清除率迅速增高，質量濃度為0.8 mg/mL時，對ABTS陽離子自由基的清除率逐漸趨于穩定。

2.4.3 還原能力

還原性能通常與還原劑的存在有關，還原劑可以通過破壞自由基鏈，給出氫原子并發揮抗氧化作用。因此，化合物或提取物的還原能力可能是其抗氧化活性的一個重要指標[34]。如圖7所示，VC的還原能力在質量濃度0.2～1.0 mg/mL時迅速增加，當質量濃度為1.0 mg/mL時，SBP-III的還原能力略高于SBP-I、SBP-II，但低于VC，粗多糖還原能力最低，且各組分隨著質量濃度的增加，還原能力逐漸增強。有研究表明多糖抗氧化性與其結構有關[31]，可能由于酸性多糖SBP-III中含有的—COOH、—OH增大了多糖的抗氧化性[20]，而粗多糖分子體積較大且含有復雜成分[35]，不利于其跨膜進入生物體內發揮生物活性，即提供氫原子的能力低于SBP-I、SBP-II、SBP-III，使其還原能力減弱。

圖7 SBP-I、SBP-II、SBP-III及粗多糖還原能力Fig.7 Reduction capacities of SBP-I, SBP-II, SBP-III and crude polysaccharides

3 結 論

沙棘粗多糖經DEAE-52纖維素柱分離純化后得到3 種組分中性多糖SBP-I和酸性多糖SBP-II、SBP-III，通過單糖組成分析得出3 種多糖主要由木糖、葡萄糖和半乳糖以不同物質的量比構成，其中葡萄糖含量最高，3 種多糖中葡萄糖占比分別為84.65%、40.8%和62.68%，說明3 種多糖均是由葡萄糖為主要成分組成的雜多糖。紅外光譜表明3 種多糖均含有糖類化合物的特征峰且推斷出SBP-I及SBP-II屬于α-構型的多糖；SBP-III屬于β-構型的多糖。抗氧化結果表明SBP-I、SBP-II、SBP-III及粗多糖對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基均具有一定的清除作用，且隨質量濃度的增加清除率逐漸升高，其中SBP-III的清除作用高于SBP-I、SBP-II和粗多糖，還原能力大小依次為：SBP-III＞SBP-II＞SBP-I＞粗多糖。由此可看出酸性多糖SBP-III、SBP-II抗氧化性高于中性多糖SBP-I，推測可能由于酸性多糖中含有—COOH、—OH，增大了多糖的抗氧化性。結果表明SBP作為天然的抗氧化劑，在健康食品的開發和生產中具有一定的研究意義。