高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法快速篩查胡椒粉中多種農藥殘留

朱曉玲，劉 杰，余婷婷,*，張 莉，王會霞，吳婉琴，曹 琦，張亞珍，楊 總

（1.湖北省食品質量安全監督檢驗研究院，湖北省食品質量安全檢測工程技術研究中心，湖北 武漢 430070；2.上海愛博才思分析儀器貿易有限公司，上海 200335）

農藥在現代農業生產過程中起著不可替代的作用，為糧食、果蔬的增產做出了重大貢獻。然而農藥的廣泛使用伴隨著日益嚴重的農藥殘留問題，農藥濫用對人體健康和生態環境等方面造成了嚴重危害[1]。胡椒粉作為一種特殊農產品，是世界上最珍貴和最有價值的香料之一[2]。主要包括黑胡椒粉和白胡椒粉兩種，其中黑胡椒粉主要是由未成熟的胡椒果實干燥加工而成，白胡椒粉主要由完全成熟的胡椒果實去皮制成[3]，既是一種很好的調味品，又是一種珍貴的藥材。中國是世界上重要的胡椒生產國之一，但作為一種小眾農作物品種，胡椒在我國的種植普面積遍較小，且較為分散，膳食消費量也不大，多數農藥生產企業缺乏在該類產品上登記農藥使用的積極性，從而造成農民無藥可用或亂用藥等問題[4]。盡管胡椒粉在我國的飲食結構中所占比例很小，但農藥亂用的現象仍易導致該類產品出現農藥殘留量過高的風險，給人們帶來健康隱患，同時使我國在貿易出口方面易遭遇貿易壁壘而造成經濟損失，建立胡椒粉中農藥殘留的高通量檢測方法，有利于對我國胡椒粉產業農藥殘留情況進行摸底，并有效促進產業的后續發展。

目前，對于農藥殘留高通量檢測，多采用液相色譜-串聯質譜法[5-9]、氣相色譜-質譜法或氣相色譜-串聯質譜法[10-14]以及高分辨質譜法[15-18]，低分辨質譜由于受分辨率、分析速度和掃描模式的限制，無法達到農藥殘留高通量篩查檢測和確證的要求，而高分辨質譜憑借其在質量精度、全質量數據采集、數據可溯源性和數據庫檢索等方面的優勢，越來越多地應用于農殘篩查檢測領域，但研究對象多集中于水果[19-20]、蔬菜[21-24]、茶葉[25-27]以及相關的加工產品等，相應的前處理方法也較為成熟，但針對胡椒粉樣品的相關檢測報道較少，因此，本研究以胡椒粉為對象，采用高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜（high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry，HPLC-Q-TOF MS）技術建立169 種農藥的高通量多殘留快速篩查方法，具有高通量、簡便、快速等特點，具有一定的實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑胡椒粉、白胡椒粉 市售。

169 種農藥標準品（純度≥95%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司、農業部環境保護科研監測所；乙腈、甲醇（均為HPLC級） 德國Merck公司；甲酸、乙酸、甲酸銨（均為HPLC級） 美國Thermo Fisher Scientific公司；N-丙基乙二胺吸附劑（primary secondary amine，PSA）、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）、弗羅里硅土（Florisil）、石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）美國Supelco公司；無水硫酸鈉、氯化鈉（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；0.22 μm有機系濾膜天津津騰公司；超純水（電阻率為18.2 MΩg cm，25 ℃）美國Millipore公司。

1.2 儀器與設備

液相色譜（Dionex Ultimate 3000）-四極桿-飛行時間質譜儀（SCIEX Triple TOF 5600+），配Analyst 1.6工作站、定性軟件PeakView、MasterView、定量軟件MultiQuant和數據庫軟件LibraryView 美國SCIEX公司；Al l e g r a X-1 5 R 型離心機 美國B e c k m a n 公司；均質器 德國IKA公司；Elmasonic P型超聲波清洗器德國Elma公司；YALBOYS型渦旋混合器 上海安譜科學儀器有限公司；ME204型分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

根據各農藥標準品的溶解性，選擇甲醇、乙腈或丙酮等溶劑配制質量濃度10 μg/mL的各農藥標準儲備液，-18 ℃避光保存。

分組配制混合標準中間液，根據農藥化合物的性質以及單標儲備液的配制溶劑，選擇性挑選每10～20 種化合物為一組，以甲醇為溶劑配制混合標準中間液，169 種目標物共分為11 組，分別編號為A～K組，配制的混合標準中間液中各化合物的質量濃度為0.5 μg/mL。

吸取A～K組各混合標準中間液適量，用空白基質溶液進行稀釋，配制適當質量濃度的基質混合標準系列工作液。

1.3.2 樣品前處理

稱取2 g（精確至0.01 g）混勻的胡椒粉樣品于50 mL塑料離心管中，加入10 mL 2%乙酸溶液，渦旋混勻后浸泡30 min，加入15 mL乙腈，渦旋混勻，加入6 g無水硫酸鎂、1.5 g無水醋酸鈉，劇烈振蕩1 min，4 000 r/min離心5 min。

移取4 m L 樣品提取上清液置于裝有凈化粉末（600 mg硫酸鎂、200 mg Florisil、200 mg C18）的離心管中，混勻，4 000 r/min離心3 min，上清液用水進行1∶1稀釋，過0.22 μm有機濾膜，待儀器分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱： Accucore a Q C18色譜柱（2.1 mmh 100 mm，2.6 μm）；流動相：甲醇（A）和5 mmol/L甲酸銨溶液（B），梯度洗脫程序見表1；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。

表1 HPLC梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for HPLC

1.3.4 TOF MS工作條件

電噴霧離子源，離子化電壓：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；霧化氣流量：55 L/h；氣簾氣流量：35 L/h；輔助氣流量：55 L/h；正離子模式檢測，母離子采集通道質譜掃描范圍m/z100～1 000，高分辨模式，去簇電壓80 V，碰撞能量10 eV。設置母離子強度大于100 cps時啟動信息依賴型子離子采集，子離子采集通道質譜掃描范圍為m/z50～1 000，高靈敏模式，去簇電壓80 V，碰撞能量范圍（35f 15）eV。質量校正液為聚丙二醇。質量偏差設置為50 mDa。

1.4 數據處理

數據庫的建立采用LibraryView軟件完成，數據的采集和處理采用Analyst、PeakView、MasterView軟件完成。采集的樣品數據在PeakView、MasterView軟件中，運用建立好的數據庫對HPLC-Q-TOF MS采集數據進行檢索匹配分析，與數據庫的保留時間、精確母離子質量數、二級質譜等相關參數進行匹配，并對陽性化合物使用MultiQuant軟件進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 數據庫的建立

2.1.1 一級精確質量數據庫

對169 種農藥化合物進行一級質譜全掃描，獲得目標物的保留時間、母離子、質量偏差，以及離子化形式等信息。在LibraryView數據庫軟件中輸入每種農藥化合物的名稱、分子式、相對分子質量、CAS號，建立169 種化合物的一級精確質量數據庫。169 種化合物的相關信息見表2。

2.1.2 二級碎片離子數據庫

設置TOF MS-IDA-Product Ion采集模式，當目標化合物的響應值超過閾值時，自動觸發在不同碰撞能量下（20、35、50 eV）采集并疊加二級碎片譜圖，將采集的二級圖譜添加至LibraryView數據庫軟件中相應的化合物項下，對于二級質譜采集質量較差的化合物單獨進樣，設置TOF MS-Product Ion方法對目標物進行一級與二級定向采集，得到質量較好的二級碎片質譜圖，并添加至譜庫，由此建立169 種目標化合物的二級譜庫，特征碎片離子信息見表2，可應用于樣品采集數據的篩查匹配，降低出現假陽性結果的概率，提高定性結果的可信度。

表2 169 種化合物的CAS號、分子式、混合標準溶液分組以及相關的質譜信息和方法學數據Table 2 CAS numbers, molecular formulas, grouping of mixed standard solutions and mass spectral parameters and methodological data of 169 compounds

續表2

續表2

續表2

2.2 樣品前處理條件優化

2.2.1 樣品提取溶劑優化

對于農藥多殘留高通量檢測，一般選用兼容性較好的溶劑進行提取。文獻報道，乙腈相比其他溶劑具有提取效率更高、對脂肪、蛋白質、糖分等雜質的去除效果更好等優點[28]，因此，本實驗選擇乙腈作為提取溶劑。

同時，由于本研究基質主要為胡椒粉類干燥脫水樣品，為了更有效地檢測樣品中農藥殘留的真實狀況，本實驗對胡椒粉樣品首先進行加水浸泡，以增加樣品的分散性以及樣品中農藥目標物的提取效率。但由于胡椒粉樣品在浸泡過程中pH值較高，約為7.8，文獻[29]指出，高pH值環境易導致部分堿敏感農藥發生降解，水直接浸泡時，部分目標物如甲基硫菌靈、甲苯氟磺胺、氧樂果等回收率較低。因此，選擇引入2%的乙酸，以對樣品的pH值起緩沖作用，減少堿敏感目標物的損失。不同pH值條件下部分農藥目標物的響應比較見圖1。

圖1 不同pH值條件下部分農藥目標物的響應比較Fig.1 Comparison of response to three selected pesticide compounds under different pH conditions

2.2.2 樣品凈化條件優化

2.2.2.1 樣品凈化必要性

圖2 凈化前后目標化合物的峰面積變化率統計結果Fig.2 Statistical results of percentage change in peak area of target compounds before and after purification

圖3 樣品嘧菌酯（A）和氟菌唑（B）對比圖譜Fig.3 Comparative chromatograms of azoxystrobin (A) and triflumizole (B) before and after sample purification

香辛料類樣品中含有大量油脂、色素、生物堿等成分，屬于復雜基質[30]，會對目標物的檢測產生干擾。本實驗通過對樣品提取液凈化前后的效果進行比較，將加標樣品提取液分成兩部分，一部分直接過濾膜進行儀器分析，另一部分采用QuEChERS方法凈化處理后過膜分析，通過比較，發現部分目標化合物在凈化前后峰面積響應變化較大，對169 種目標化合物的峰面積變化率（面積變化率/%=（凈化后目標物峰面積/凈化前目標物峰面積-1）h 100）計算，并對計算數據進行統計。從圖2可以看出，118 種目標物凈化前后峰面積變化不大，變化率為20%以內，51 種化合物凈化前后峰面積變化率超過20%，其中15 種凈化后峰面積響應變低，分別為異丙威、丙硫克百威、仲丁靈、醚磺隆等；36 種化合物凈化后峰面積響應明顯變高，分別為腈苯唑、氟嗎啉、辛硫磷、抑霉唑、肟菌酯、甲咪唑煙酸等。圖3列出了部分化合物凈化前后的對比效果圖譜，嘧菌酯、氟菌唑在不凈化條件下基本不出峰。因此，凈化對樣品處理結果具有一定的改善，可有效降低部分化合物的檢出限，且對大多數化合物沒有造成較大的損失影響，因此，有必要對樣品提取液進行凈化處理，同時可有效避免直接進樣可能會造成的色譜柱和質譜系統的污染[28]。

2.2.2.2 凈化吸附劑選擇及用量優化

采用QuEChERS方法進行樣品凈化，一般QuEChERS方法多采用PSA、C18、GCB、Florisil吸附劑粉末對樣品基質中的雜質成分進行吸附，以達到樣品凈化的目的，但研究表明，各種吸附劑的凈化效果是非選擇性的，在吸附雜質的同時也會對部分農藥目標物產生吸附，影響回收率。考察4 種吸附劑粉末對本研究中169 種目標物的吸附情況，結果見表3，共有72 種化合物受到吸附劑不同程度的吸附，未列于表3中的97 種化合物不受吸附劑影響，4 種吸附劑中，GCB對大多數農藥目標物吸附性較強，PSA、C18和Florisil吸附劑對少量農藥品種具有吸附性，PSA主要吸附甲磺隆、芐嘧磺隆、醚苯磺隆、醚磺隆等磺酰脲類除草劑以及咪唑乙煙酸、甲咪唑煙酸咪唑啉酮類除草劑；C18粉末主要吸附甲基硫菌靈、甲胺磷、敵菌靈、福美雙、氯氟吡氧乙酸等化合物；Florisil主要對甲基硫菌靈、氟甲喹、甲胺磷、福美雙、噻蟲嗪等化合物有吸附。綜合實驗結果，可選擇PSA、C18和Florisil對樣品進行凈化。胡椒粉主要成分為胡椒堿和揮發性油，有研究表明，PSA對胡椒堿和揮發性油的去除效果并不理想，PSA只能去除少量的油性化合物，如能去除韭菜提取物中約0.3%的脂肪，但不適合含有超過3%脂肪的白胡椒粉和黑胡椒粉樣品[31]，因此，本研究選擇C18和Florisil吸附劑對樣品提取液進行凈化，在兼顧并確保樣品的凈化效果及各目標化合物的回收率的前提下，對吸附劑的用量進行優化，最終確定每4 mL提取液加入C18吸附劑200 mg、Florisil吸附劑200 mg進行樣品凈化。

表3 PSA、C18、PCB、Florisil吸附劑對農藥目標物的吸附情況Table 3 Adsorption efficiency of pesticide compounds by PSA, C18,PCB and Florisil

2.3 HPLC-Q-TOF MS工作條件的優化

2.3.1 HPLC流動相組成及洗脫梯度優化

比較考察甲醇-5 mmol/L乙酸銨、甲醇-5 mmol/L甲酸銨、乙腈-5 mmol/L甲酸銨3 種流動相體系對目標化合物的影響。對3 種流動相體系下各農藥化合物的峰面積數據以及出峰時間、峰形等信息進行綜合分析，結果表明，不同流動相體系下，農藥目標化合物的分離度以及質譜響應強度均存在差異，在乙腈流動相體系下，各農藥目標物出峰較早，且出峰時間段密集，分離度相較于甲醇體系稍差。在質譜響應強度方面，部分農藥化合物峰面積響應比較見圖4，在甲醇-5 mmol/L甲酸銨體系下，各農藥目標物的響應值更高，因此，選擇甲醇-5 mmol/L甲酸銨作為最終流動相體系。

圖4 流動相體系對部分農藥化合物的峰面積響應影響Fig.4 Effects of different mobile phase systems on peak area responses of selected pesticide compounds

在HPLC流動相組成體系確定的情況下，對流動相洗脫梯度條件進行優化，比較洗脫梯度對目標物的保留及分離情況影響。根據實驗結果最終選擇表1中的流動相梯度，得到169 種農藥目標化合物（15 ng/mL）相應的提取離子色譜圖見圖5，各目標化合物在3～17 min出峰，色譜峰出峰時間段分布均勻，流動相梯度設置合理。

圖5 169 種農藥目標物提取離子色譜圖Fig.5 Ion chromatograms of mixed standard solution of 169 pesticides (15 ng/mL)

2.3.2 TOF MS工作條件優化

為了獲得可靠豐富的實驗數據，本研究利用儀器的信息依賴采集（information dependent acquisition，IDA）工作模式，建立TOF MS-IDA-Product Ion工作流程，在一次進樣采集下，同時獲得一級高分辨質譜圖和二級高分辨質譜圖。鑒于農藥化合物均為小分子物質，因此，設定TOF MS一級全掃描質量范圍為100～1 000 Da，Product Ion二級掃描質量范圍為50～1 000 Da，IDA閾值設定為100 cps，當目標化合物的響應值超過閾值時，自動觸發在不同碰撞能量下（20、35、50 eV）采集并疊加二級碎片譜圖，同時開啟儀器的動態背景扣除功能，可極大降低本底背景的二級質譜信號強度，提高樣品中極低含量目標物的MS/MS信號。

2.4 基質效應

基質效應是質譜檢測中普遍存在的現象[32]。實驗考察黑胡椒粉和白胡椒粉的基質效應，在純試劑和基質提取液中添加標樣，比較目標物的信號峰面積，得到基質效應（基質效應=基質標樣的峰面積/試劑標樣的峰面積）[33]。結果顯示，黑胡椒粉和白胡椒粉的基質效應趨勢一致，共有131 種化合物基質效應小于0.85，存在較強的基質抑制效應；12 種化合物基質效應在0.85～1.15之間，基質效應較弱；26 種化合物基質效應大于1.15，存在基質增強效應；表明胡椒粉基質對農藥檢測結果存在較大的影響，因此，采用基質匹配法進行定量分析，以保證檢測結果的定量準確性。

2.5 方法驗證

2.5.1 標準曲線、線性范圍與檢出限

用空白樣品提取液稀釋，制備不同質量濃度的混合基質標準溶液，以峰面積（Y）為縱坐標，相應的質量濃度（X）為橫坐標繪制標準曲線，各目標化合物在5～100 ng/mL范圍內，有136 種化合物線性相關系數大于0.95（其中93 種化合物的相關系數大于0.99），可進行定量分析，另外33 種化合物線性相關系數小于0.95，只能進行定性分析。

根據GB/T 27417ü 2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》，方法檢出限主要是指用特定方法可靠地將分析物測定信號從特定基質背景中識別或區分出來時分析物的最低濃度或量，確定檢出限的方法較多，包括目視評價法、空白標準偏差法、校準方程評估法、信噪比法等[34]。本研究采用信噪比法進行136 種定量檢測目標化合物的檢出限確定，在基質空白樣品中添加標準溶液，以3 倍信噪比計算檢出限，結果見表2。對于定性檢測的33 種化合物，通過在空白樣品中添加不同水平的標準溶液，每個水平分別隨機檢測10 次，記錄檢出結果的陽性率和陰性率，確定陽性檢測結果具備100%可靠性時的臨界值作為檢出限，結果詳見表2。

2.5.2 回收率和精密度

采用空白胡椒粉樣品作為基質進行加標回收實驗，應用1.3.2節方法進行樣品前處理，以及1.3.3節和1.3.4節儀器方法進行測定，得到平均回收率為26%～140%，相對標準偏差為1.5%～36.0%。

2.6 實際樣品的測定結果

采用本實驗建立的HPLC-Q-TOF農藥殘留快速篩查技術對市售的16 批次胡椒粉樣品（包含黑胡椒粉和白胡椒粉）中169 種農藥殘留進行測定。其中10 批次樣品檢出甲霜靈，為殺菌劑；8 批次樣品檢出啶蟲脒，為殺蟲劑；1 批次樣品檢出莠滅凈，為除草劑；所檢出農藥的精確質量數據庫匹配以及二級碎片譜庫匹配，綜合得分均高于90 分，實際樣品中甲霜靈農藥碎片離子譜圖與數據庫譜圖鏡像比對如圖6所示。采用基質匹配標準曲線對篩查出的農藥進行定量，所檢樣品中甲霜靈的最高含量為102.2 μg/kg，啶蟲脒的最高含量為32.6 μg/kg，莠滅凈含量為22.3 μg/kg。現行有效的GB 2763ü 2016《食品中農藥最大殘留限量》以及即將實施的GB 2763ü 2019《食品中農藥最大殘留限量》中均未對胡椒中的這3 種農藥進行最高殘留限量規定。

圖6 胡椒粉樣品中甲霜靈的碎片離子鏡像信息Fig.6 Relative intensities of fragment ions in mass spectrum of phorate sulfoside in pepper powder

3 結 論

本實驗建立HPLC-Q-TOF MS快速篩查胡椒粉中多種農藥殘留的分析方法，建立了169 種農藥目標化合物的高分辨一級和二級質譜數據庫，并對樣品的前處理條件以及液相色譜、質譜條件進行了優化，本方法將QuEChERS前處理與高分辨質譜檢測結合，可同時對樣品中的目標物進行定性、定量分析，提高檢測效率，該方法簡便、快速、靈敏，適用于胡椒粉中農藥殘留高通量篩查確證分析。