植物病原真菌早期檢測技術及其在橡膠樹炭疽病預測預報中的應用

杜艷楠，王 萌,2，馬建強，張 宇,2，梁曉宇,2

（1.海南大學 植物保護學院，海口 570228; 2.熱帶農林生物災害綠色防控教育部重點實驗室，海口 570228;3.海南大學 計算機與網絡空間安全學院，海口 570228）

真菌病害是植物病害中數量最大的一類，占植物病害總數的70%～80%。許多危害重、分布廣的作物病害，如銹病、黑粉病、霜霉病、白粉病等都是由真菌引起的。與形態觀察、次生代謝產物分析等常規檢測技術不同，病原真菌的早期檢測技術檢測周期短、靈敏度高，能幫助快速檢測到侵染初期或潛伏期的病原菌，并獲悉其生長狀態和發病階段，以備人們有充分的時間采取科學合理的防治措施，最大限度地減少經濟損失。因此，植物病原菌早期檢測技術是防治病害大面積暴發的有效手段。從傳統的組成物質觀察和氣相色譜檢測到免疫學方法的建立，再到分子檢測手段的不斷成熟，病原菌早期檢測技術越來越簡便和精準，為建立植物病害的早期診斷方法和預測預報模型奠定了良好基礎。

橡膠樹(Hevea brasiliensis)是天然橡膠的主要來源，天然橡膠是一種重要的戰略資源，約占全球橡膠消費總量的40%，世界每年對天然橡膠的需求不斷增長[1?2]。炭疽菌(Colletotrichum)侵染橡膠樹引起的炭疽病(Colletotrichum leaf disease，CLD)是亞洲天然橡膠產量下降的主要原因[3?4]，該病害可導致橡膠樹葉片變形和壞死，進而發生次生性落葉，嚴重影響膠乳產量[5]。由于炭疽菌具有潛伏侵染能力，橡膠樹炭疽病的預測預報一直存在較大的技術難點。橡膠樹炭疽菌典型的作用方式為半活體營養型侵染，在侵染初期通過與宿主細胞共生逃避抗性機制，同時滿足自身營養和能源需求，隨后進行壞死型營養生長，迅速擴散并殺死宿主細胞[6?7]。炭疽菌具有潛伏期的存在和作用方式轉換的特點，因此不易被發現；在氣候條件適宜的情況下，極短的時間內即可暴發成災；預測難度大，給炭疽病防治造成困難。因此，建立潛伏侵染狀態下的炭疽菌檢測技術成為了橡膠樹炭疽病早期診斷和流行預測的關鍵所在。筆者綜述了常用的植物病原真菌早期檢測技術，包括基于菌體結構組成的檢測技術和基于核酸序列PCR 擴增的檢測技術，比較了各種早期檢測技術的優缺點，論述了實時熒光定量PCR 早期檢測技術建立的關鍵步驟及在橡膠樹炭疽病預測預報模型中的應用潛力，為橡膠樹炭疽菌早期檢測技術和預測預報模型的建立奠定基礎。

1 植物病原真菌早期檢測技術

1.1 基于菌體結構組成的檢測技術基于菌體結構組成的早期檢測技術主要包括結構定量法、酶聯免疫吸附法、GUS 染色法、熒光檢測法等，這些技術在分子生物學檢測方法出現以前被廣泛應用于植物病原真菌的早期檢測，在操作應用過程中具有明顯的優缺點。結構定量法依賴于真菌子實體結構、甾醇或幾丁質的定量[6?9]，通過圖像分析或氣相色譜、液相色譜分析進行定量檢測，操作過程繁瑣、定量不夠準確，特別是在病原真菌的活體營養階段，定量較困難。酶聯免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)是通過抗原抗體特異性結合檢測病原真菌[10?12]。操作相對復雜，目前多用于真菌病毒的檢測[13?15]和次生代謝物的研究[16?17]。GUS 染色法通過構建病原菌的GUS 轉化株，以X-Gluc 為底物，用組織化學法進行染色，對病原菌進行顯微鏡觀察檢測[18?19]。GUS 染色法觀察效果好，可準確、穩定地檢測到病原真菌，但其反應底物X-Gluc 價格昂貴，早期檢測過程對植物組織有破壞，不能持續檢測病原菌后續侵染過程，且不適宜田間檢測。熒光檢測法是將綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）基因轉移到病原菌中，在病原菌啟動子的控制下進行表達，通過檢測綠色熒光蛋白水平進行定量，使細胞生長和形成動態可視化，并且可用于細胞的檢測和定量[20?23]，更適宜用于理論研究。

1.2 基于核酸序列PCR 擴增的檢測技術隨著分子生物學和生物信息學的蓬勃發展，核酸分子生物學技術在微生物檢測領域的應用成為了國內外研究者的關注焦點，近年來，分子生物學檢測技術在植物病原菌的早期檢測和病害診斷過程中得到了廣泛認可。目前常用的分子生物學檢測技術為核酸序列PCR擴增技術以及PCR 擴增的衍生技術。

1.2.1 常規PCR 技術常規PCR 是分子生物學檢測的重要手段，充分應用在植物病原菌鑒定和檢測中。LIU 等為了研究引起中國橡膠樹炭疽病的病原菌多樣性和地理分布特點，從中國4 個省份18 個試驗田中采集感病葉片，分離大量病原菌株，通過PCR 擴增病原菌的內部轉錄間隔區(ITS)、肌動蛋白基因(ACT)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)、β?微管蛋白2 基因（β-tubulin2）和CAL 5 個基因序列，通過多位點系統發育和表型特征分析，將病原菌分為5 個種群[3]。PARIKKA 等利用常規PCR 技術分別對人工和自然感染條件下顯癥和未顯癥的草莓組織進行尖孢炭疽菌的早期檢測，均獲得陽性PCR 結果。因此，PCR 技術可以用于檢測草莓組織中侵染時期或潛伏時期的尖孢炭疽菌，但其需要PCR 后產物分析，檢測靈敏度有限，特異性也相對較差[24]。

1.2.2 SCAR-PCR 技術序列特異性擴增區(Sequence characterized amplified regions, SCAR)通常由隨機擴增多態性DNA(Random amplified polymorphism, RAPD)轉化而來，即回收RAPD 標記片段并根據此片段設計新的特異性引物——SCAR 引物，再用SCAR 引物進行PCR 獲得特異性較強、穩定性較高的SCAR 標記[25]。由于SCAR 引物比RAPD 引物長，且與DNA 完全匹配，具有更高的穩定性和可重復性，目前該技術已應用于炭疽菌等植物病原真菌的早期檢測[26?27]，如NITHYA 等針對引起印度甘蔗紅腐病的病原菌C.falcatum設計SCAR 引物，并用炭疽菌屬其他種的DNA 評價SCAR 引物的特異性，結果僅從C.falcatum中擴增出442 bp 的片段，而且在C.falcatum純培養中檢測靈敏度達到0.1 ng DNA，在甘蔗組織中檢測靈敏度達到5 ng DNA[28]。

1.2.3 巢式PCR 技術巢式PCR 技術利用2 組不同的引物進行目標序列的擴增，第一對引物擴增產物為第二對引物擴增模板，巢式PCR 技術有效提高了檢測的準確性和靈敏度[29]。張磊等對梨輪紋病菌(Botryosphaeria berengeriana)、梨炭疽病病原菌(C.gloeosporioides) 進行常規PCR 和巢式PCR 檢測，結果表明，只能從Botryosphaeria berengeriana和C.gloeosporioides中擴出317 bp 和325 bp 的特異性條帶，且巢式PCR 靈敏度比常規PCR 提高約105倍[30]。CHEN 等建立了1 種檢測大豆種子中炭疽菌(C.lindemuthianum)的巢式PCR 檢測方法。結果顯示，常規的一步式PCR 最低能從大豆種子中檢測炭疽菌DNA 量為10 pg，而巢式PCR 檢出限低至10 fg DNA，相當于1 個C.lindemuthianum的基因組DNA，靈敏度提高了1 000 倍[31]。可見巢式PCR 是具有高靈敏度的病原菌檢測方法，但其操作步驟繁瑣，進行第二次PCR 擴增引起交叉污染的幾率較大，容易出現假陽性結果。

1.2.4 環介導等溫擴增技術環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是1 個單步擴增過程，需要4～6 個引物，利用strand-displacement Bst DNA 聚合酶橫向結合到不同的位點，可以在等溫條件下進行高特異性的擴增[32]。LAMP 能很好地排除干擾，提取方法簡單快速，可以避免復雜的DNA 提純程序，可用于植物病原菌的早期診斷和原位檢測[33?34]。TIAN 等針對大豆炭疽病病原菌C.truncatum Rpbl基因序列，設計并篩選了4 對特異性引物，通過LAMP 檢測大豆種子中的C.truncatum。在LAMP 反應產物中加入顯色劑SYBR 后，只有當C.truncatum存在時反應產物才會出現黃綠色，檢出限可達100 pg·μL?1DNA[35]。KHAN 等以Ypt1基因為靶點，分別用常規PCR、巢式PCR、實時熒光定量PCR 和LAMP 等方法檢測馬鈴薯晚疫病菌Phytophthora infestans。結果表明，LAMP 特異性最高，最低可檢測濃度為0.128 pg·μL?1DNA，比常規PCR 靈敏1 000 倍，比巢式PCR 靈敏10 倍，比實時熒光定量PCR 靈敏100 倍。隨后KHAN 等在番茄早疫病菌Alternaria solani中對上述幾種方法進行了評價，結果表明，LAMP 靈敏度是常規PCR 的10 倍，巢式PCR 比LAMP 靈敏100 倍，實時熒光定量PCR 比LAMP靈敏1 000 倍[36]。因此，LAMP 技術簡單、快速、特異性強，在病原真菌早期檢測中有較大的應用潛力，但其在不同菌種和不同實驗條件下靈敏度有較大差異。

1.2.5 實時熒光定量PCR 技術實時熒光定量PCR (Real-time quantitative PCR，QPCR)通過探測PCR 擴增產物的熒光信號，對擴增進程進行實時檢測，根據擴增指數期的循環閾值(Ct)定量DNA。按照發射熒光信號的化學物質不同，分為TaqMan 探針法和 SYBR Green I 染色插入法。TaqMan 探針法利用可與目的序列進行雜交的探針來指示擴增產物；由于需要探針識別目的序列，特異性較強，設計探針的難度較大，成本較高。熒光染料SYBR Green I 可以與所有雙鏈DNA 的小溝結合發射熒光，不識別特異序列，對目的核酸序列要求較低，簡單方便、容易操作、成本較低。實時熒光定量PCR 可以對各種環境樣品(包括宿主組織，土壤，水和空氣)中的目標真菌DNA 進行準確、可靠和高通量的定量分析，為診斷接種閾值水平，流行病學和宿主-病原體相互作用研究開辟了新方法，為檢測和研究植物致病性和拮抗性真菌提供了更多途徑。近年來，實時熒光定量PCR 技術已應用于不同寄主植物中炭疽菌的定量以及生長動態的監測，解決了炭疽菌半活體營養型侵染帶來的檢測難題[37?39]，成為了構建炭疽菌早期檢測技術的首選[37]。DAUCH 等利用SYBR Green I 插入染料法建立了C.coccodes實時熒光定量PCR 技術，可最低檢出0.25 pg·μL?1DNA，并利用該技術監測了C.coccodes在寄主苘麻上的侵染動態[6]；DEBODE 等利用TaqMan 探針法建立了C.acutatum實時熒光定量PCR 技術，檢出限為0.05 pg·μL?1DNA，測定了C.acutatum在草莓葉片上侵染過程中的菌體數量[37]；CHEN 等針對菜豆炭疽病病原菌C.lindemuthianum，通過TaqMan 探針法和SYBR Green I 插入染料法建立的實時熒光定量PCR 方法，能夠特異性檢出C.lindemuthianum，并證明了菜豆炭疽病斑面積與菌體數量的相關性[38]。

2 炭疽菌QPCR 早期檢測技術的建立

QPCR 包括相對定量分析和絕對定量分析2 種定量分析方法，計算初始模板基因拷貝數用絕對定量分析，比較不同處理間特定基因表達量的變化用相對定量分析。絕對定量方法更多的應用于植物病原真菌的檢測，以病原真菌基因組DNA 或保守序列的重組質粒為標準品繪制標準曲線，利用特異性引物進行擴增，通過測定樣品Ct 值即可對病原真菌進行定量。

2.1 炭疽菌特異性引物設計（1）選擇目標序列。引物特異性是準確識別和定量目標菌株的關鍵，ITS、ACT、GAPDH 等基因在真菌基因組中保守且種間變異性大，常用于菌種鑒定[40?44]和特異性引物設計[45]。有研究表明，ITS 是最有可能成功識別范圍最廣的真菌的基因，在種間和種內變異最明確，并被提議作為主要的真菌條形碼標記物[46]。DEBODE 等利用ITS 和β-tubulin2基因設計引物分別建立了草莓尖孢炭疽菌的實時PCR 檢測方法。研究表明，ITS 基因特異性引物擴增效率是β-tubulin2基因特異性引物擴增效率的3～4 倍，靈敏度前者是后者的66 倍[37]。SREENIVASAPRASAD 等利用β-tubulin2基因特異性引物成功從發病和未發病的橄欖中檢測到尖孢炭疽菌。研究結果表明，基于尖孢炭疽菌和膠孢炭疽菌βtubulin2基因特異性引物可用于QPCR 檢測無癥狀或感染早期的植物組織中的炭疽菌[47]。（2）驗證引物特異性。首先利用NCBI 數據庫中的BLASTN 將設計的特異性引物序列與GenBank NR 數據庫進行比對。其次用設計好的特異性引物同時擴增多個不同菌株，進一步驗證引物特異性[48]。菌株一般是與目標菌株同種、同屬不同種、侵染同一植株同一部位和不同部位的或與目標菌株侵染環境相關的病原菌，菌株數量幾個到幾十、幾百個不等[39,48?49]。（3）優化引物特異性及敏感性。通過結合SCAR 標記，或設計巢式引物，可以增加引物特異性和檢測靈敏度[29,36]。SRINIVASAN 等利用SYBR 作為熒光染料建立了1 種基于SCAR 標記的QPCR 檢測方法，用于檢測辣椒種子和果實中的C.capsicii。Srinivasan 等開發的SCAR 引物對C.capsicii具有高度特異性，在7 個目標分離株菌的基因組DNA 中均擴增出預期的250 bp的片段，在其他3 種辣椒致病真菌和4 種常見炭疽菌的基因組DNA 中沒有擴增。檢測體系在C.capsicii純培養中檢測靈敏度為1 pg，在辣椒果實中為2.5×104pg[39]。

2.2 炭疽菌純培養的定量檢測利用已知起始拷貝數的標準樣品繪制標準曲線。擴增過程中熒光強度與PCR 產物的數量呈對應關系，只要對熒光信號進行實時監測并得到未知樣品的Ct 值，即可通過標準曲線計算未知樣品的起始拷貝數。（1）標準曲線的繪制方法。標準品可以是重組質粒也可以是gDNA，濃度范圍為1 fg·μL?1～100 ng·μL?1[37,50]。DAUCH 對C.coccodes的gDNA 進行了1/5、1/10、1/20、1/100稀釋，通過計算目標gDNA 的數量并校正稀釋因子，發現1/10 稀釋對樣品定量最優[6]。取5～7 個濃度梯度，設置2～3 個重復，加入空白對照，進行QPCR，獲得標準曲線[36,51?52]。（2）靈敏度檢測。對目標基因序列和分生孢子進行梯度稀釋，QPCR 能檢測到的最低拷貝數和最低孢子數即反應體系的靈敏度。SCARLETT和KELLY 建立的黃瓜鐮刀菌QPCR 檢測技術，最低能檢測到100 拷貝的目的片段和25 個分生孢子[37,50]。YANG 等建立的檢測大豆炭疽菌的雙重QPCR 技術最低能檢測到1 pg 的C.chlorophyti、C.glycines、C.incanumgDNA 和0.1 pg 的C.truncatumgDNA[53]。

2.3 植物組織中炭疽菌的定量檢測（1）人工接種是研究植物病害的常規方法，被廣泛地用于研究病原菌致病性[2,54?56]、病原菌侵染過程[57]、植物對病原菌的抗性[58]、病害流行及控制措施[59]等。人工接種的方法各不相同，但都要求植物病害發病率高，且盡可能接近自然狀態下發病情況。植物病原真菌接種方法主要有噴霧法[52]和針刺法[2,40]。用于噴霧法的炭疽菌分生孢子懸浮液濃度通常在1～1×106個·mL?1范圍之內[28,49,52,60]。接種和噴施部位要符合目標菌株特性[61?63]，如研究侵染草莓葉片的尖孢炭疽菌，葉片噴施孢子后26 ℃和90%濕度培養即可[37]。（2）檢測限是衡量檢測方法準確性的重要指標，對QPCR 在植物組織或復雜DNA 環境中的檢測靈敏度進行評價是檢測體系建立的關鍵一步。SCARLETT 等在1～106個·μL?1的目標菌株PCR 產物中混入1 μL 濃度為10 ng·μL?1的環境樣品DNA，來檢測體系的靈敏度和特異性[50]。DEBODE 等用未受感染植物材料對100%受感染植物材料進行系列稀釋，獲得含0.001%～10%受感染植物材料的樣品，對樣品進行QPCR 檢測，建立Ct 值與模板濃度對數(0.001%～10%受感染植物材料)之間的線性回歸曲線，計算QPCR 在受感染植物材料中的檢測限[37]。（3）監測病原菌生長動態，即在不同時間檢測病原菌生物量的變化。檢測時間根據實驗目的而定，研究出現癥狀之前的病原菌生長動態，檢測時間早、間隔短。DEBODE 等研究草莓葉片中尖孢炭疽菌早期侵染動態，分別在接種后2、4、6、24、32、48、72、96、168 和264 h 進行檢測[37]。研究病害嚴重程度與病原菌生長動態的關系，檢測時間廣而分散。DAUCH 等研究絨毛草發病程度與其病原菌C.coccodes的生物量的關系，檢測時間為0、1、2、5、7 和14 d[6]。

3 橡膠樹炭疽菌早期檢測技術的應用前景

橡膠樹病害作為一種頻發性生物災害，嚴重制約了橡膠樹的經濟生產。過去的病害預測方法多數是根據病害侵染知識、多年實地經驗及根據大量的觀察數據加以歸納統計得出結果，所依據的預報因子主要包含菌量、氣象因素，預報量或為發生期，或為發生量，或為定性定量的等級數值，由于其以病原物的特性和所處條件為依據，應用范圍受到嚴格的限制，所建立的模型為經驗模型，忽略了各因素在流行過程中不同階段作用的差異。基于侵染預測的系統模型可很好地補充經驗模型的不足，其根據侵染是否已經發生和發生數量或程度，結合未來幾天的天氣預報，即可提前一兩天作出發病趨勢預測，較經驗模型更準確和具體，更有利于指導當時的藥劑防治。這類預測方法早有研究，如馬鈴薯晚疫病的HYER 氏法和WALLIN 法[64?65]、蘋果黑星病的MILLS 預測表都已有幾十年的歷史[66]。

基于前期種屬鑒定[3]、流行病學[5]、化學防治[67]、生物防治[68]和分子生物學研究[69]，筆者認為橡膠樹炭疽病預測預報模型構建是防治炭疽病大面積發生和流行的有效途徑。基于橡膠樹炭疽菌設計特異性引物，建立橡膠樹炭疽病QPCR 早期檢測技術，可以快速、靈敏、特異地對癥狀不明顯甚至無癥狀的橡膠樹進行炭疽菌的定量檢測和生長動態監測。流行病學研究表明，菌種、菌量、橡膠樹品系、物候、氣候、立地環境等因素均影響炭疽病的發生和流行，其中菌量和易感病組織是病害發生的基礎條件，溫度和濕度是病害流行的關鍵因素[70]。利用QPCR 技術結合顯微觀察檢測致病菌種、菌量，收集發病時間、發病程度和環境數據，利用侵染模型建立橡膠樹炭疽病預測預報模型（包括菌量、菌種、溫度、濕度、立地環境、物候、品系），后將侵染模型與田間氣象監測數據進行擬合。基于病原菌分子檢測技術的預測預報模型將為橡膠樹炭疽病等熱帶林木重要病害的預測預報奠定良好基礎，在其他經濟林木重要病害的預測預報中具有廣闊的應用前景。

4 展 望

早期常用的植物病原真菌檢測技術有結構定量法、ELISA、GUS 染色法、GFP 熒光檢測法等，這些方法具有特異性及可視化等優點，但測量參數易受到植物因素干擾，定量準確性不足。PCR 技術的出現為檢測技術的發展帶來極大動力，尤其基于實時熒光定量PCR 的檢測技術，克服了以往檢測技術特異性差、靈敏度低、易受干擾、操作繁瑣等問題，能夠快速、靈敏地對病原菌進行定量并監測其生長動態，為植物病原真菌檢測提供了重要的技術支持。將QPCR 檢測技術應用在基于侵染預測的系統模型，可進一步明確發病率、病情指數與菌量、林分因子、氣候條件等之間的關系，有利于提高林木病害預測的準確度，以掌握病害暴發的關鍵時期，提供充足的病害防治時間。因此，QPCR 檢測技術在經濟林木重要病害的預測預報中具有廣闊的應用前景。

致謝：海南省熱帶農業科學院王立豐研究員在本文寫作過程中給予了指導，特此感謝！