藜蘆的質量控制研究

程 韜 王影超 陳韋佳 萇 玲 舒 柯*

1.貴州省食品藥品檢驗所，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學，貴州 貴陽 550025

藜蘆在2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》中系指藜蘆VeratrumnigrumL.、黑紫藜蘆Veratrumjaponicum(Baker)Loes.f.、蒙自藜蘆VeratrummengtzeanumLoes.f.及狹葉藜蘆VeratrumstenophyllumDiels的干燥根或根莖。秋季采挖，洗凈，曬干，可催吐、祛痰、殺蟲，用于中風痰涌、風癇癲疾、疥癬、惡瘡[1]。本次實驗研究的藜蘆為藜蘆VeratrumnigrumL.，由貴州省食品藥品檢驗所李楊老師鑒定，藜蘆中含有虎杖苷和白藜蘆醇，虎杖苷具有較強的生物活性，對心肌細胞、血管平滑肌細胞、抗血小板聚集、改善微循環等有顯著作用，此外還能減輕多種因素造成的組織器官損傷，具有保護肝細胞，降血脂及抗脂質過氧化等作用[2]。白藜蘆醇具有抗癌、抗菌、抗炎、抗心血管疾病、抗衰老和抗神經退行性疾病等藥理作用[3]，質量標準中有顯微鑒別和理化鑒別，故增加TLC鑒別及虎杖苷和白藜蘆醇的含量測定對完善藜蘆的質量控制提供重要的科學依據。

1 儀器材料

1.1 儀器 ThermoFisher UItimate 3000高效液相色譜儀；梅特勒托勒多 MS202TS型電子天平(十萬分之一)；梅特勒托勒多 XP26型電子天平(百萬分之一)；KQ-500DB型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；millipore超純水機。

1.2 材料 虎杖苷對照品(111575-200502)、白藜蘆醇對照品(111535-201703)均來自中國食品藥品檢定研究院；藜蘆(批號301)采自安順市關嶺縣、藜蘆(批號302)采自安順市關嶺縣、藜蘆(批號303)采自安順市紫云縣、對照藥材由貴州省食品藥品檢驗所李楊老師鑒定為藜蘆VeratrumnigrumL.。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純，青島海洋化工硅膠G薄層板。

2 方法與結果

2.1 藜蘆的薄層色譜鑒別方法[4]取本品粉末 1 g，加濃氨試液1.5 mL使浸潤，放置30 min，加二氯甲烷30 mL加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取藜蘆對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取上述兩種溶液各5～l0 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上以環己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(5∶3∶1∶1.5∶0.5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，再噴以碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

2.2 藜蘆的薄層色譜鑒別結果 經過薄層色譜對溫度、濕度的方法學驗證，圖1表明此鑒別方法分離度良好，斑點清晰，信息全面，用于藜蘆的薄層鑒別方法可行。

2.3 HPLC同時測定虎杖苷和白藜蘆醇的方法[5-7]

2.3.1 波長選擇 分別取虎杖苷、白藜蘆醇對照品在200～400 nm波長范圍內進行紫外波長掃描，虎杖苷和白藜蘆醇均在306 nm處有較大吸收，又結合HPLC-DAD光譜圖對比，確定306 nm為最佳檢測波長。光譜圖如圖2所示。

2.3.2 色譜條件 色譜柱Thermo C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)，以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按表1進行梯度洗脫。檢測波長：306 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫

2.3.3 對照品溶液的制備 精密稱取虎杖苷、白藜蘆醇對照品，加甲醇制成每1 mL各含虎杖苷10 μg、白藜蘆醇20 μg的混合溶液，搖勻，即得。

2.3.4 供試品溶液的制備 取過三號篩的粉末1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足失去重量，搖勻，0.45 μm微孔濾過，即得(實驗全程需避光操作)。

2.3.5 系統適應性試驗 取對照品溶液、供試品溶液注入液相色譜儀，供試品色譜中呈現與虎杖苷對照品、白藜蘆醇對照品保留時間相同的色譜峰。色譜圖如圖3所示。

2.3.6 線性關系實驗 精密吸取虎杖苷對照品(0.2004 mg/mL)和白藜蘆醇對照品(0.4056 mg/mL)各1 mL、2.5 mL、5 mL、7.5 mL、10 mL分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得虎杖苷濃度分別為20.04 μg/mL、50.10 μg/mL、100.2 μg/mL、150.3 μg/mL、200.4 μg/mL；白藜蘆醇濃度分別為40.56 μg/mL、101.4 μg/mL、202.8 μg/mL、304.2 μg/mL、405.6 μg/mL的對照品溶液，分別吸取上述對照品溶液各10 μL，按2.3.2色譜條件進樣測定，記錄色譜峰面積，以對照品質量(μg)為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)繪制工作曲線，進行回歸處理，虎杖苷回歸方程為y=462.8668x+2159.6973(r=0.9998)，白藜蘆醇回歸方程為y=525.4858x-302.5944(r=0.9999)，結果表明虎杖苷在0.2004～2.004 μg范圍內呈現良好的線性關系，白藜蘆醇在0.4056～4.0560μg范圍內呈現良好的線性關系。

2.3.7 精密度實驗 分別精密吸取對混合照品溶液10 μL，在同一色譜條件下，連續進樣6次，測定峰面積，虎杖苷對照品峰面積RSD%為1.0%，白藜蘆醇對照品峰面積RSD%為0.9%，表明儀器精密度良好。

2.3.8 穩定性實驗 精密稱取一份樣品，按2.3.4制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，分別于配制后0、3、6、18、24 h，按2.3.2項下色譜條件進樣測定，測定虎杖苷峰面積RSD%為1.7%，白藜蘆醇峰面積RSD%為1.3%，結果表明供試品溶液中虎杖苷和白藜蘆醇在24 h內穩定。

2.3.9 重復性實驗 精密稱取同一批號樣品6份，按2.3.4方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，按2.3.2項下色譜條件進樣測定，虎杖苷平均含量為0.3701 mg/g,RSD=0.5%，白藜蘆醇平均含量0.8781 mg/g，RSD=0.7%，表明該方法重復性良好。

2.3.10 回收率實驗 精密稱定已知含有量的樣品(虎杖苷平均含量0.3701 mg/g、白藜蘆醇平均含量0.8781 mg/g)6份，精密加入對照品虎杖苷0.240 mg，白藜蘆醇0.483 mg，按2.3.4方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，按2.3.2項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，結果虎杖苷和白藜蘆醇的平均回收率分別為99.6%和100.1%,RSD(n=6)分別為1.1%和0.95%，表明實驗方法準確度較高，結果見表2。

表2 虎杖苷和白藜蘆醇回收率實驗

2.3.11 耐用性試驗 分別采用3支不同品牌的C18色譜柱waters xbridge(4.6 mm×250 mm，5 μm)、迪馬(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Thermo(4.6 mm×250 mm，5 μm)在戴安U3000高效液相色譜儀上對同一批藜蘆樣品進行測定，精密吸取供試品溶液10 μL，按2.3.2色譜條件進樣測定，記錄峰面積，結果虎杖苷和白藜蘆醇的RSD%分別為2.2%、2.0%。

2.4 樣品含量測定結果 取上述3批藜蘆藥材，按2.3.4項下方法制備供試品溶液并測定色譜峰面積，計算藜蘆藥材虎杖苷和白藜蘆醇的含量，結果見表3。

表3 樣品測定結果

3 討論

根據參考文獻，選擇甲醇-水、乙腈-水流動相按表1梯度洗脫表進行洗脫，結果乙腈-水在表1梯度洗脫條件下可以使供試品目標化合物有效分離，再選擇乙腈-1%磷酸溶液、乙腈-2%磷酸溶液、乙腈-4%磷酸溶液照表1梯度洗脫表進行比較，結果上述各系統均可以使供試品目標化合物有效分離，峰型也較理想，但因乙腈-水系統配制方便，成本低，毒性低，故最終選擇乙腈-水為最佳流動相系統。

虎杖苷和白藜蘆醇對光照不穩定，在進行虎杖苷和白藜蘆醇含量測定操作時均要避光操作，如不避光操作，對照品色譜圖中會出現雜峰，疑為對照品在光照條件下被降解轉化為其他化合物，后續會對供試品中化合物的光照降解途徑進行進一步研究。

用甲醇、乙醇超聲提取1 h，甲醇效果較好；再用25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇提取，結果用50%甲醇提取溶劑提取所測得的虎杖苷和白藜蘆醇峰面積最高，含量較高，甲醇提取次之；但是在50%甲醇提取溶劑下反復進行準確度實驗，虎杖苷的回收率滿足要求，白藜蘆醇的回收率僅為50%～60%，選用甲醇作為提取溶劑進行準確度實驗，虎杖苷和白藜蘆醇的回收率均能達到藥品質量標準分析方法驗證指導原則要求。

本實驗對藜蘆VeratrumnigrumL.的TLC鑒別及HPLC含量測定的研究，方法可靠穩定，簡便易行，可較全面、可靠地控制藜蘆的質量，為其質量標準的提升制定提供可靠依據。