灰色關聯分析法評價不同產地牡丹皮藥材質量

王 斌 梁偉龍 林欽賢 康志英* 王其豐 郭長達

1.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.寧夏回族自治區隆德縣六盤山中藥資源開發有限公司，寧夏 隆德 756300 3.安徽省亳州市滬譙藥業有限公司，安徽 亳州 236800；

牡丹皮為毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮，味苦、辛，微寒，歸心、肝、腎經，具有清熱涼血、活血化瘀的功效[1]，主產于安徽、山東、河南、湖南、湖北、四川、重慶等地。牡丹皮中主含酚及其苷類、單萜及其苷類兩大類，亦含有機酸、三萜、黃酮、香豆素、揮發油、多糖及微量元素等多種成分[2-7]。

灰色關聯分析法為灰色系統理論的重要組成部分，主要針對信息不完全、機制不明確的灰色系統，根據數據序列曲線的相似程度分析因子間的量化和序化，實現對系統的預測、決策等功能[8-11]，目前已在許多中藥研究中應用，如基于灰色關聯分析方法評價甘肅產紅芪質量[12]、牡丹皮不同采收期質量綜合評價研究[13]，采用灰色關聯度法綜合評價不同采收期的牡丹皮藥材質量，取得了許多科技成果。為了客觀、全面地評價不同產地牡丹皮藥材的質量，本實驗以17個不同產地牡丹皮藥材為研究對象，按《中華人民共和國藥典》2015版方法測定浸出物和總灰分，采用HPLC法同時測定其沒食子酸、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酸、丹皮酚和苯甲酰芍藥苷含量，結合灰色關聯分析法，建立灰色關聯度模型，為牡丹皮藥材質量評價提供參考依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)、MX5型、XS-204型電子天平(Mettler Toledo)、DHG-9245A電熱鼓風干燥箱、HWS-26型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)、SXL-1208型程控式箱式電爐(上海精宏實驗設備有限公司)

1.2 材料 沒食子酸(110831-201605，純度90.8%)、兒茶素(110877-201604，純度99.2%)、芍藥苷(110736-201539，純度96.4%)、丹皮酚(110708-201407，純度99.9%)和苯甲酸(100419-200301)購自中國食品藥品檢定研究院；氧化芍藥苷(MUST-16021505，純度99.93%)和苯甲酰芍藥苷(MUST-16061803，純度99.28%)購自成都曼斯特有限公司；HPLC級甲醇(Merck)和磷酸(阿拉丁)；其余試劑為分析純，超純水。牡丹皮藥材于2017年先后于安徽、山東、湖南、湖北、重慶、四川等牡丹皮藥材主產區收集，經廣州市香雪制藥股份有限公司康志英高級工程師鑒定為毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮，樣品來源信息見表1。

表1 不同產地牡丹皮藥材來源信息

2 方法與結果

2.1 浸出物 按《中華人民共和國藥典》2015年版四部醇溶性浸出物測定法(通則2201)項下的熱浸法測定，用乙醇作溶劑。

2.2 總灰分 按《中華人民共和國藥典》2015年版四部總灰分測定法(通則2302)進行測定。

2.3 多成分含量測定[14]

2.3.1 對照品溶液制備 取對照品沒食子酸、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酸、丹皮酚和苯甲酰芍藥苷適量，精密稱定，加50%甲醇水分別制成每1 mL含沒食子酸0.5 μg、0.5 μg、15 μg、20 μg、20 μg、50 μg、50 μg的混合對照品溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液制備 取牡丹皮藥材粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流提取1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密移取續濾液1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，過0.45 μm的濾膜，即得。

2.3.3 色譜條件 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；檢測器為DAD檢測器；檢測波長為230 nm，258 nm(氧化芍藥苷)；流動相為甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～15 min，10%A→32%A；15～25 min，32%A→48%A；25～40 min，48%A→58%A)；流速為1 mL·min-1；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。在此條件下，取對照品溶液、供試品溶液分別進樣10 μL分析，HPLC色譜圖如圖1所示。

2.3.4 線性關系考察 精密吸取“2.3.1”項下的混合對照品溶液1、3、5、7、10、15 μL，在“2.3.3”項色譜條件下分析，以對照品的量為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸，結果見表2。

2.3.5 精密度試驗 精密吸取“2.3.1”項下的混合對照品溶液，連續進樣6次，記錄7個對照品峰面積，結果顯示7個成分的峰面積RSD均小于1.5%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩定性試驗 按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.3”項色譜條件下分別于0、3、6、9、12、18、24 h進樣分析，記錄7個成分的峰面積，結果顯示7個成分峰面積RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.3.7 重復性試驗 精密稱定同一樣品粉末6份，按“2.3.2”方法平行制備供試品溶液，進樣分析，記錄峰面積，計算含量。結果顯示7個成分的含量RSD均小于2.0%，表明該方法重復性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的牡丹皮粉末約0.25 g，共6份，加入與7個成分等量的對照品，按照“2.3.2”項下方法平行制備供試品溶液，計算加樣回收率，結果見表3。

表3 加樣回收率試驗結果 (%)

2.4 各指標成分含量測定 取不同產地牡丹皮藥材樣品，分別按“2.1”、“2.2”、“2.3”項下方法測定浸出物、總灰分、以及沒食子酸、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酸、丹皮酚和苯甲酰芍藥苷的含量，結果見表4。

表4 牡丹皮樣品9種指標成分的含量測定結果 (%，n=3)

2.5 灰色關聯度分析法的建立

2.5.1 參考序列選擇 設有n個研究樣品，每個樣品有m項評價指標，組成評價單元序列，記為{Xik}(i=1，2，3……n；k=1，2，3……m；本研究中n=17，m=9)。為了統一藥材質量評價標準，采用將低指標高優化的方法，本試驗將總灰分進行取倒數轉換，與沒食子酸、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酸、丹皮酚、苯甲酰芍藥苷和浸出物指標共同組成指標矩陣。藥材質量評價指標統一后，將最優參考序列的各指標對應n個不同產地樣品對應指標的最大值，記為{Xsk}=max(1≤i≤n){Xik}，最差參考序列的各指標對應n個不同產地樣品對應指標的最小值，記為{Xtk}=min(1≤i≤n){Xik}。

2.5.2 原始數據規格化處理 以平均值變換最為常用，見公式(1)。

(1)

式(1)中Yik為數據經規格化處理后的數值，Xik為原始測定數值，Xk為第n個藥材樣品的第k個指標的平均值。

2.5.3 關聯系數的計算 分別按公式(2)和公式(3)計算相對于最優、最差參考序列的關聯系數。

(2)

式(2)中Δmin= min|Yik-Ysk|，Δmax=max|Yik-Ysk|(i=1,2……n;k=1,2……m)

(3)

2.5.4 關聯度的計算 相對于最優參考序列、最差參考序列的關聯度分別按公式(4)、(5)計算得到。

(4)

(5)

2.5.5 相對關聯度的計算 最佳評價單元是評價單元與最優參考序列關聯程度最大，同時與最差參考序列的關聯程度最小值，所以將評價單元序列同時相對于最優參考序列和最差參考序列的相對ri關聯度定義為公式(6)。

(6)

2.5.6 樣品數據集的建立 測定不同產地牡丹皮藥材中9種成分的含量，建立牡丹皮藥材質量灰色模式識別數據集，見表4。

2.5.7 數據規格化處理 將原始測定數值按公式(1)進行數據規格化處理，結果見表5。

表5 不同產地牡丹皮藥材的原始數據規格化處理

表6 評價單元序列相對于最優參考序列的關聯系數

表7 評價單元序列相對于最差參考序列的關聯系數

2.5.9 關聯度與相對關聯度的計算 分別按公式(4)、(5)計算各評價單元相對于最優、最差參考序列的關聯度ri(s)、ri(t)，按公式(6)計算出17個不同產地牡丹皮藥材樣品的相對關聯度ri，并進行質量排序，結果見表8。

表8 牡丹皮藥材關聯度、相對關聯度及質量排序

2.5.10 藥材質量評價 相對關聯度ri越大，表明該產地牡丹皮藥材的質量評價越高，ri排序結果可作為藥材質量高低評價的依據。由表8可見，17個產地牡丹皮藥材樣品的相對關聯度在0.314～0.597之間，其中6個產地樣品的相對關聯度>0.50，5個產地樣品的相對關聯度在0.45～0.50之間，6個產地樣品的相對關聯度<0.45，表明不同產地牡丹皮藥材質量存在差異。山西運城絳縣(S07)、山西運城聞喜(S06)、安徽銅陵(S01)、安徽南陵(S09)和陜西商洛(S15)的相對關聯度分別為0.597、0.583、0.546、0.537、0.532，排名前5位，藥材質量評價優。湖北恩施利川(S10)、重慶墊江(S17)、亳州十九里(S03)、亳州五馬(S04)、亳州華佗(S02)和山東菏澤(S05)的相對關聯度分別為0.414、0.401、0.392、0.381、0.376、0.314，排名后6位，藥材質量評價較差。

3 討論

3.1 流動相系統的選擇 在建立牡丹皮藥材多成分含量測定的過程中，曾對流動相洗脫系統進行優選，選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%醋酸水溶液等多種流動相洗脫系統進行比較，結果顯示，甲醇-0.1%磷酸水溶液流動相系統基線平穩，干擾較小，各指標成分峰分離度良好，故選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液為牡丹皮的流動相系統。

3.2 提取方式的選擇 本試驗考察超聲提取、回流提取的提取方式，結果顯示，回流提取的芍藥苷和丹皮酚峰面積均高于超聲提取，且重復性結果優于超聲提取。比較回流提取0.5 h、1 h、1.5 h，回流1 h和1.5 h含量相近，而芍藥苷峰面積略高于0.5 h，綜合考慮，確定牡丹皮供試液的提取方式為回流提取1 h。

3.3 粉末粒徑的選擇 本試驗考察2號篩、3號篩、4號篩不同篩目的粉末粒徑，結果顯示，2號篩樣品丹皮酚的重復性較3號篩、4號篩的差。3號篩與4號篩樣品的重復性總體情況良好，兩者含量相近，其芍藥苷峰信號均高2號篩粉末樣品，綜合考慮，確定選擇牡丹皮粉末粒徑為3號篩。

3.4 定容溶劑的選擇 本試驗在稀釋定容過程中考察0%～100%的甲醇溶液，結果顯示，0%～40%的甲醇溶液稀釋的色譜圖中色譜峰數量較少，而60%～100%的甲醇溶液稀釋的部分色譜峰的峰型較差，分離度低，部分色譜峰出現裂峰，而50%的甲醇溶液稀釋較為良好，色譜峰數量較多，信息量較大。綜合考慮，確定選用50%的甲醇溶液進行稀釋定容。

3.5 檢測波長的選擇 本試驗考察230 nm、258 nm、265 nm、274 nm、292 nm等檢測波長，結果顯示，檢測波長為258～292 nm，色譜峰數量減少，包括芍藥苷在內的一些特征信息未表達出來；檢測波長為335 nm時，基本上只有丹皮酚一個色譜峰，而檢測波長為230 nm時，色譜圖的峰數目、信息量較大，綜合考慮，確定選擇230 nm為牡丹皮的檢測波長。

4 結論

本實驗結果表明，不同產地牡丹皮藥材質量存在差異。山西運城產地牡丹皮藥材中兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷和浸出物含量明顯高于其他產地，說明其藥材質量評價較高；安徽銅陵、南陵所產的牡丹皮藥材質量排序第3、第4名，說明其藥材品質較優，這也與安徽銅陵和南陵為牡丹皮的道地產區相吻合；湖北恩施、重慶墊江、亳州、山東菏澤產地牡丹皮樣品的相對關聯度排名靠后，說明其藥材質量較差。

牡丹皮化學成分眾多，成分的多樣性致使其質量很難控制，單一的指標成分不能準確反映牡丹皮的藥效和質量，使其在分析評價藥材的質量時損失信息量太多。本研究以相對關聯度為測度，結合灰色關聯分析法，建立一種牡丹皮藥材質量綜合評價的模型，客觀整體地反映牡丹皮藥材的內在質量，為牡丹皮藥材的綜合質量評價提供了新思路，也為牡丹皮資源的開發利用提供參考依據。