基于PD-1/PD-L1表達(dá)影響探討四君子湯對(duì)NK細(xì)胞及結(jié)腸癌作用的研究①

朱月伊 宋運(yùn)來(lái) 石曉蘭

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海 200062)

結(jié)腸癌是世界常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，2018年就已經(jīng)有接近180萬(wàn)新患病例[1]。最近有研究表明，結(jié)腸癌的患病概率與吸煙相關(guān)[2]。盡管近年的存活率逐漸上升，但其難發(fā)現(xiàn)、易復(fù)發(fā)的特性使患者的治療前景不容樂(lè)觀[3]。

結(jié)腸癌由于發(fā)現(xiàn)不夠及時(shí)，其治療往往需要通過(guò)手術(shù)和放化療聯(lián)合應(yīng)用，確診后，大部分患者會(huì)選擇手術(shù)治療，手術(shù)治療成為了結(jié)腸癌治療的主要手段[4]。然而，手術(shù)等療法存在復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的可能，導(dǎo)致結(jié)腸癌的治療更加棘手。

近年來(lái)，免疫療法發(fā)展迅速，NK細(xì)胞得到了前所未有的重視。其不通過(guò)繁瑣的信號(hào)通路調(diào)控就可直接快速地清除感染或被腫瘤侵占的細(xì)胞。而NK細(xì)胞自身?yè)碛械亩鄠€(gè)膜表達(dá)活化受體及不同表型子集，也是發(fā)揮它強(qiáng)大免疫反應(yīng)的關(guān)鍵[5-6]。正因?yàn)檫@種特殊性，一旦NK細(xì)胞表面受體被信號(hào)介導(dǎo)抑制，就會(huì)失去對(duì)病毒防御和對(duì)腫瘤監(jiān)視的能力[7]。程序性死亡受體1(PD-1)是一種免疫學(xué)檢查位點(diǎn)，常見(jiàn)于T淋巴細(xì)胞，該位點(diǎn)可與其對(duì)應(yīng)的配體結(jié)合，激活相關(guān)信號(hào)通路，抑制T淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)，從而發(fā)生免疫逃逸。但與T淋巴細(xì)胞相關(guān)的NK細(xì)胞在PD-1方向還在深入探索中。大量研究數(shù)據(jù)顯示，NK細(xì)胞對(duì)PD-1/PD-L1通路產(chǎn)生影響[8]。NK細(xì)胞表面存在PD-1，PD-1受體不僅抑制T細(xì)胞，還抑制NK細(xì)胞，且腫瘤活性的提升與PD-1表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)，尤其在結(jié)腸癌、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌中[9-11]。因此，抑制PD-1表達(dá)可能為NK細(xì)胞加強(qiáng)免疫反應(yīng)提供幫助。STAT3是一種由770個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其通過(guò)STAT結(jié)構(gòu)區(qū)域與特定的磷酸酪氨酸序列結(jié)合在信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用[12]。而作為轉(zhuǎn)錄因子，STAT3可直接結(jié)合啟動(dòng)子增加PD-1、PD-L1表達(dá)，也可以通過(guò)多種信號(hào)通路間接誘導(dǎo)這些因子的免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)[13-17]。盡管IFN-γ在臨床多用于治療惡性腫瘤，但最新研究顯示其還可能促進(jìn)腫瘤發(fā)展，并借由JAK/STAT3通路產(chǎn)生影響[18]。

四君子湯出自《太平惠民和劑局方》，是中醫(yī)補(bǔ)益正氣的經(jīng)典代表方，由人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草4藥相伍而成，方中人參大補(bǔ)元?dú)鉃榫帲仔g(shù)燥濕補(bǔ)氣為臣藥，茯苓滲濕泄熱為佐藥，甘草和中益土為使藥，四藥相合共行補(bǔ)脾益氣之功效，臨床上常用于治療慢性胃炎、消化性潰瘍、結(jié)腸癌等脾胃氣虛病癥。

1 材料與方法

1.1材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)；RPMI-Medium培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；胰酶與血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；MTT、SDS購(gòu)自中國(guó)Sangon公司；人外周血淋巴分離液TBD購(gòu)自中國(guó)灝洋生物公司；人NK細(xì)胞富集試劑盒購(gòu)自加拿大Stemcell Technology公司；RNA試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；IFN-γ ELISA試劑盒購(gòu)自中國(guó)LIANKE公司；PCR引物購(gòu)自蘇州泓迅生物科技股份有限公司；Napabucasin STAT3抑制劑購(gòu)自美國(guó)MCE公司；血液標(biāo)本購(gòu)置自上海市長(zhǎng)海醫(yī)院血站，標(biāo)本來(lái)自健康人，所有的指標(biāo)都在范圍內(nèi)；四君子湯中藥制備于上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，藥材購(gòu)自上海市雷允上藥業(yè)有限公司。常用離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；梯度離心機(jī)、超低溫冰箱及酶標(biāo)儀等購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司；小型垂直電泳槽及小型Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1NK細(xì)胞的分離 將得到的標(biāo)本以1∶1比例稀釋于含有3%雙抗的PBS(1X)溶液，待充分稀釋后，與人外周血淋巴分離液以2∶1比例置于15 ml 小離心管，共12 ml，先放入4 ml分離液后緩慢加入8 ml稀釋標(biāo)本，配平至離心機(jī)，25℃、400 XG、20 min離心。離心后分為4層，用吸管緩慢少量多次吸取第2層液面(即淋巴細(xì)胞層)，盡量吸盡，并再次加入含3%雙抗的PBS(1X)溶液，25℃、200 XG下離心10 min，棄上清，加入含20%血清、1%雙抗的1640培養(yǎng)液，電子計(jì)數(shù)至3×106個(gè)/ml,并將其以10 ml/皿均勻鋪開(kāi)，24 h后吸取上清液重復(fù)上述第二步離心，所得沉淀即為低濃度NK細(xì)胞。利用NK細(xì)胞富集試劑盒進(jìn)行磁珠分選，排除非目的細(xì)胞，最后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD56+以評(píng)估NK細(xì)胞純度，純度 >90%即為實(shí)驗(yàn)所需。

1.2.2細(xì)胞的處理與分組 單一NK細(xì)胞鋪板每孔3×106個(gè)/ml。在共培養(yǎng)模型中，NK細(xì)胞與HCT116比例為5∶1鋪板，并盡量保持孔內(nèi)體積較小，HCT116細(xì)胞以1×104個(gè)/10 μl加至5×104個(gè)/100 μl 的NK細(xì)胞中。設(shè)200 ng/ml IFN-γ處理的NK細(xì)胞為IFN-γ組，200 ng/ml IL-2處理的NK細(xì)胞為IL-2組(陽(yáng)性對(duì)照組)，5 mg/ml四君子湯處理的NK細(xì)胞為SJZ組，100 μmol/L奧沙利鉑處理的NK細(xì)胞為OXA組(陽(yáng)性對(duì)照組)，正常處理的NK細(xì)胞為Con組，分別單獨(dú)培養(yǎng)NK細(xì)胞，與HCT116細(xì)胞共培養(yǎng)24 h及48 h。同時(shí)以相同方式再加入STAT3信號(hào)抑制劑后，即為R-STAT3組、R-SJZ組、R-OXA組，共培養(yǎng)24 h及48 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3建立小鼠結(jié)腸癌皮下瘤模型 用生理鹽水將CT-26細(xì)胞調(diào)整為5×106個(gè)/ml,以0.2 ml/只皮下注射至小鼠右側(cè)腋下，接種2 d后檢查小鼠皮下瘤生長(zhǎng)情況，待瘤體達(dá)到100 mm3后，通過(guò)完全隨機(jī)法將小鼠分為4組，每組6只，分別為空白組(CON)、生理鹽水組(NACL)、四君子湯組(SJZ)和奧沙利鉑組(OXA)，空白組不作任何處理，NACL組、SJZ組以0.2 ml/(只·d)灌胃給藥，OXA組每隔1 d進(jìn)行1次腹腔注射給藥，0.1 ml/(20 g·只)，并持續(xù)2周。

1.2.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性 細(xì)胞處理到24 h及48 h后，單一NK細(xì)胞每孔加入10 μl 5 mg/ml的MTT,3.5 h后，每孔加入100 μl 10%SDS溶液,24 h后，上樣酶標(biāo)儀檢測(cè)，讀取波長(zhǎng)570 nm處OD值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。共培養(yǎng)模型中的HCT116細(xì)胞需要先用移液器輕吹，少量多次緩慢吸取上清液，加入新的含20%血清、1%雙抗的培養(yǎng)液100 μl后，再進(jìn)行上述常規(guī)的加入MTT操作。

1.2.5qRT-PCR檢驗(yàn)mRNA表達(dá) 細(xì)胞共培養(yǎng)24 h 及48 h后，輕吹各孔得到上清液，由于HCT116腫瘤細(xì)胞與NK細(xì)胞體積密度不同，以差速離心法得到NK細(xì)胞沉淀。以相同方法得到腫瘤細(xì)胞沉淀，加入適量TRIzol溶液溶解，通過(guò)異丙醇，氯仿，無(wú)水乙醇獲得RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)，PCR反應(yīng)條件為：95℃ 30 s,95℃ 5 s,60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)，最后得到數(shù)值后利用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)值統(tǒng)計(jì)。小鼠皮下瘤的RNA提取需要先將腫塊剪碎后放入磁珠，再加入適量TRIzol溶液并放到動(dòng)物RNA提取儀器中60 Hz、2次/min振蕩，再進(jìn)行后續(xù)操作。

1.2.6ELISA檢測(cè)IFN-γ水平 細(xì)胞共培養(yǎng)24 h及48 h后，獲得各組上清液，根據(jù)IFN-γ試劑盒說(shuō)明書(shū)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，最后得到的OD值代入方程中進(jìn)行換算得到IFN-γ分泌量。小鼠眼球血液的上清液需以3 000 r/min 4℃離心5 min。

1.2.7活體成像技術(shù) 小鼠給藥2周后，以每只小鼠200 μl/20 g、15 mg/ml的熒光素鉀鹽進(jìn)行腹腔注射，根據(jù)體重利用戊巴比妥鈉麻醉[50 μl/(20 g·只)]，待小鼠失去行動(dòng)能力后，置于活體成像儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 摘取小鼠皮下瘤后，各組剪取相同統(tǒng)計(jì)大小的腫塊進(jìn)行RIPA裂解，并放入組織勻漿器中充分研磨，以12 000 r/min 4℃離心5 min，得到上清液。根據(jù)蛋白濃度試劑盒標(biāo)準(zhǔn)方程，按照步驟操作后在酶標(biāo)儀波長(zhǎng) 570 nm 處取得OD值，換算得到蛋白濃度。根據(jù)PD-L1蛋白大小配膠，10%的分離膠，5%的濃縮膠，蛋白在定量后根據(jù)體積加入5 X上樣緩沖液，95℃金屬浴10 min，隨后以3 000 r/min、4℃離心1 min。上樣完畢后，恒壓70 V電泳30 min,然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)線指示轉(zhuǎn)為恒壓90 V，視情況而定等待1～2 h，隨后轉(zhuǎn)膜并封閉，洗膜后加入PD-L1的稀釋一抗4℃孵育過(guò)夜。回收一抗洗膜3次后，加入二抗，室溫孵育2 h，再次洗膜3次，最后加化學(xué)發(fā)光試劑顯影，得到數(shù)據(jù)后通過(guò)Image J軟件換算灰度值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.9免疫組化實(shí)驗(yàn) 將取得的皮下瘤進(jìn)行石蠟切片，用二甲苯與無(wú)水乙醇常規(guī)脫蠟，滅活后進(jìn)行封閉并加入抗體孵育，二抗孵育完成后PBS(1 X)沖洗4次，根據(jù)顯色試劑盒說(shuō)明書(shū)，加入顯色試劑，最后用無(wú)水乙醇沖洗、封片并在顯微鏡下觀察。利用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行灰度值測(cè)定并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1IFN-γ可抑制NK細(xì)胞生長(zhǎng) IFN-γ在200 ng/ml 下可以抑制NK細(xì)胞生長(zhǎng)(P<0.05)，四君子湯在NK細(xì)胞存在的情況下，可以增強(qiáng)對(duì)HCT116細(xì)胞的殺傷作用(P<0.01)，奧沙利鉑在抑制NK細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，也抑制了HCT116細(xì)胞增殖(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 IFN-γ和四君子湯對(duì)NK細(xì)胞活性及共培養(yǎng)模型中HCT116的增殖影響

2.2四君子湯可降低NK細(xì)胞分泌IFN-γ的水平 四君子湯可降低單一NK細(xì)胞IFN-γ的分泌(P<0.05)，且在與STAT3抑制劑聯(lián)合使用后抑制作用更加明顯(P<0.05)。在共培養(yǎng)模型中，四君子湯聯(lián)合STAT3抑制劑依舊可降低IFN-γ分泌(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 四君子湯和STAT3抑制劑對(duì)NK細(xì)胞及共培養(yǎng)模型中IFN-γ分泌的影響

2.3四君子湯可降低NK細(xì)胞 mRNA表達(dá) 四君子湯可降低共培養(yǎng)模型中NK細(xì)胞IFN-γ(P<0.05)、PD-1(P<0.05)、STAT3(P<0.01)的表達(dá)(P<0.01)，且在與STAT3抑制劑聯(lián)合后，更為顯著降低IFN-γ(P<0.05)、PD-1(P<0.05)、STAT3 24 h(P<0.05)。相同的是，四君子湯與STAT3抑制劑聯(lián)合使用也可降低共培養(yǎng)模型中HCT116細(xì)胞PD-L1、STAT3 mRNA的表達(dá)(P<0.05)。見(jiàn)表3、4。

表3 四君子湯和STAT3抑制劑對(duì)共培養(yǎng)模型中NK細(xì)胞mRNA的影響

表4 四君子湯和STAT3抑制劑對(duì)共培養(yǎng)模型中HCT116細(xì)胞 mRNA的影響

2.4四君子湯可抑制小鼠結(jié)腸癌皮下瘤生長(zhǎng)，并降低PD-L1蛋白及抗體表達(dá) 四君子湯可降低PD-L1蛋白及抗體表達(dá)(P<0.05，圖1)，還可抑制小鼠結(jié)腸癌皮下瘤的生長(zhǎng)，其熒光強(qiáng)度低于NACL組和空白組(P<0.05，圖2)。

圖1 PD-L1蛋白表達(dá)

圖2 小鼠熒光強(qiáng)度

2.5四君子湯可降低小鼠結(jié)腸癌皮下瘤PD-L1 mRNA表達(dá)和血液中IFN-γ分泌 四君子湯可降低小鼠結(jié)腸癌皮下瘤PD-L1 mRNA表達(dá)(P<0.01)，并可降低其血液中IFN-γ分泌(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 PD-L1 mRNA及IFN-γ水平

3 討論

NK細(xì)胞在腫瘤的殺傷中起關(guān)鍵作用，當(dāng)NK細(xì)胞表面的PD-1與腫瘤的免疫檢查位點(diǎn)PD-L1結(jié)合時(shí)，NK細(xì)胞表達(dá)的活化受體將無(wú)法激活，細(xì)胞活化、分裂、細(xì)胞毒性等能力減弱，導(dǎo)致腫瘤免疫逃脫，使免疫反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行。因此，降低PD-1或PD-L1表達(dá)，抑制二者結(jié)合及信號(hào)通路形成可有效避免NK細(xì)胞衰弱，達(dá)到增強(qiáng)免疫反應(yīng)的目的[10，19]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，STAT3的異常激活可通過(guò)傳播腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間串?dāng)_導(dǎo)致腫瘤免疫反應(yīng)的抑制，在自身激活活化的同時(shí)，促進(jìn)其他免疫抑制因子表達(dá)[20]。最近發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞PD-1表達(dá)可上調(diào)STAT3 mRNA[21]，免疫檢查位點(diǎn)抑制劑和STAT3抑制劑聯(lián)合使用在臨床上也達(dá)到了預(yù)期效果[22]。同時(shí)，也有研究發(fā)現(xiàn)，STAT3在腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞中過(guò)度活化會(huì)影響先天免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，從而引起免疫抑制。例如在先天免疫細(xì)胞中存在大量的STAT3，可能會(huì)引發(fā)以降低IFN-γ為代表的炎性介質(zhì)的一系列反應(yīng)，從而減緩炎癥信息的傳遞，導(dǎo)致免疫抑制，在適應(yīng)性免疫中，STAT3活性的持續(xù)升高會(huì)導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞活性降低，導(dǎo)致抗腫瘤作用降低[23-25]。四君子湯作為中藥的經(jīng)典方可以殺傷腫瘤細(xì)胞[26]，最近發(fā)現(xiàn)其中蘊(yùn)含的多糖可以對(duì)淋巴細(xì)胞、脾細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞發(fā)揮不同的免疫作用[27]，而加味四君子湯也具有很好的抗腫瘤活性，還可以改善荷瘤小鼠的肝腎功能，其作用可能歸功于IL-2、TNF-α等[28]。最近有研究表明，LY294002 PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑可抑制IFN-γ分泌和經(jīng)番茄素處理的肺癌細(xì)胞PD-L1的表達(dá)[29]。

綜上所述，四君子湯可影響NK細(xì)胞活性及結(jié)腸癌增殖，其功能與STAT3抑制劑相近，可能通過(guò)調(diào)控STAT3信號(hào)干預(yù)IFN-γ分泌，降低PD-1/PD-L1的表達(dá)從而改善NK細(xì)胞活性并抑制結(jié)腸癌的細(xì)胞的生長(zhǎng)，可為結(jié)腸癌的臨床治療及實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。