lncRNA SNHG8調(diào)控miR-335-5p表達影響膀胱癌增殖、遷移和侵襲的機制研究①

夏儒銳 梁培育 王聲興 歐善際 彭曉暉

(海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，海口 570102)

膀胱癌是世界范圍內(nèi)最常見的癌癥之一，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢。膀胱癌分為兩大類，非肌肉浸潤性和肌肉浸潤性[1]。大多數(shù)情況下的膀胱癌(75%～80%)是非肌肉侵襲性腫瘤，其復發(fā)率高達50%～70%[2]。盡管已有多種治療方法，如根治性膀胱切除術、保留膀胱的經(jīng)尿道切除術、化學療法和放射療法，但轉移性膀胱癌的總生存期僅為13個月[3]。因此，迫切需要進一步探索膀胱癌腫瘤的發(fā)生和轉移分子機制，并找到新的治療策略來改善膀胱癌患者的預后。非編碼RNA是一種不編碼蛋白質(zhì)，沒有完整開放閱讀框的轉錄副產(chǎn)物RNA，起初被認為是基因轉錄的“噪音”，現(xiàn)代研究證明，其在人類的多種癌癥中均具有調(diào)控作用[4]。長鏈非編碼RNA是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，微小RNA是長度介于18～24個核苷酸之間的短鏈內(nèi)源性非編碼RNA，二者在人類癌癥的進展中均具有調(diào)控作用[5]。lnc RNA 小核仁RNA宿主基因8(small nucleolus RNA host gene 8，SNHG8)在人類的很多癌癥中均出現(xiàn)表達異常[6]，但是其在膀胱癌中是否會出現(xiàn)異常尚且未知。已知miR-335-5p在膀胱癌中作為抑癌基因發(fā)揮作用[7]，但是其與SNHG8之間的關系尚未完全清楚。本研究旨在探索lnc RNA SNHG8在膀胱癌細胞中增殖、遷移、侵襲和凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 膀胱移行上皮細胞SV-HUC-1、膀胱癌細胞SW780、5637、T24、HT-1197均購自中國科學院細胞庫；噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑購自碧云天；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒購自南京諾唯贊生物公司；BD Transwell小室購自北京明陽科華生物公司；RNA抽提試劑盒、反轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購自日本TaKaRa。實驗中所涉及的引物和質(zhì)粒(si-con、si-SNHG8、miR-con、miR-335-5p mimics、SNHG8)由上海吉瑪公司設計并合成。pCDNA3.1(+)載體質(zhì)粒購自上海酶研生物公司。

1.2方法

1.2.1細胞的培養(yǎng) 將膀胱移行上皮細胞SV-HUC-1、膀胱癌細胞SW780、5637、T24、HT-1197用含有10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行常規(guī)細胞培養(yǎng)。

1.2.2細胞的轉染與分組 把正常培養(yǎng)的SV-HUC-1、SW780、5637、T24、HT-1197細胞分別標記為SV-HUC-1組、SW780組、5637組、T24組、HT-1197組。將SW780細胞隨機分為NC組(不做任何處理)、si-con組(轉染si-con)、si-SNHG8組(轉染si-SNHG8)、pcDNA組(轉染pcDNA)、pcDNA-SNHG8組(轉染pcDNA-SNHG8)、miR-con組(轉染miR-con)、miR-335-5p組(轉染miR-335-5p mimics)、si-SNHG8+anti-miR-con組(共轉染si-SNHG8和anti-miR-con)、si-SNHG8+anti-miR-335-5p組(共轉染si-SNHG8和anti-miR-335-5p)，各組細胞均用5倍量的脂質(zhì)體進行轉染，轉染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用qRT-PCR法檢測轉染效率，轉染成功后用于后續(xù)的實驗研究。

1.2.3qRT-PCR法檢測細胞中SNHG8、miR-335-5p的表達 收集細胞，將其用RNA抽提試劑盒、反轉錄試劑盒提取RNA并合成cDNA。再用qRT-PCR試劑盒檢測其中SNHG8、miR-335-5p的相對表達量。結果以GAPDH、U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算SNHG8、miR-335-5p的表達。引物信息(5′-3′)：SNHG8上游引物AAGTTTACAAGCATGCGCGG，下游引物TCAAACTGACGGTTCTCGGG；GAPDH 上游引物CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC，下游引物ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC；miR-335-5p上游引物UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGC，下游引物CUCUCAUUUGCUAUAUUCA；U6上游引物CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物AACGCTTCACGAATTT-GCGT；反應條件為：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，40個循環(huán)，最后延伸至72℃ 5 min。

1.2.4Western blot檢測細胞中Ki-67、Cleaved caspase-3、MMP-2、MMP-9的蛋白表達 收集培養(yǎng)48 h的待檢測細胞，充分裂解后，提取總蛋白，用BCA法定量。加入5倍體積的上樣緩沖液對蛋白進行沸水浴變性，用上清進行上樣。將蛋白小心加入梳子孔中，注意不要溢出孔外。電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上，整個轉膜系統(tǒng)需要在4℃低溫條件下進行。然后5%脫脂奶粉封閉處理，一抗稀釋液4℃孵育過夜處理。第2天，將膜轉移至二抗稀釋液中室溫下孵育2 h。最后在暗室中進行顯影、定影和曝光。用Image J分析條帶的灰度值。

1.2.5MTT法檢測細胞存活率 收集培養(yǎng)48 h的待檢測細胞，調(diào)整細胞至5×105個/ml，取100 μl加入96孔板，依次加入20 μl的MTT液和150 μl的DMSO混勻溶解后，在490 nm波長下檢測細胞的吸光度。細胞存活率=A490樣品/A490對照×100%。

1.2.6流式細胞術檢測細胞凋亡 收集培養(yǎng)48 h的待檢測細胞，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒要求操作，依次加入Annexin V-FITC、PI，避光反應結束后，上流式細胞儀，檢測分析結果。

1.2.7Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲 采用帶基質(zhì)膠的小室檢測細胞的侵襲數(shù)量，不含基質(zhì)膠的小室檢測細胞的遷移數(shù)量。將培養(yǎng)48 h的待檢測細胞調(diào)整至5×105個/ml，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，從中吸取200 μl平鋪在上室聚碳酸酯膜表面，以浸濕膜為準。取600 μl含血清的培養(yǎng)基加入下室內(nèi)。將小室置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24 h后取出小室。配置甲醇固定液和1 g/L的結晶紫染色液。先擦去上室膜的上表面殘余細胞，再將膜侵入甲醇中固定30 min，然后轉移至染液中染色15 min，結束后將膜進行封片，鏡檢。選取5個視野進行拍照計數(shù)，取平均值。每個樣本做3個復孔，實驗重復3次。

1.2.8生物信息學分析 通過在線預測網(wǎng)站mircode(http://mircode.org/)預測SNHG8的靶點。

1.2.9雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測細胞熒光活性 通過熒光素酶與底物結合發(fā)生化學發(fā)光的特性，將化學合成的目的基因序列(SNHG8-WT)和突變序列(SNHG8-MUT)克隆在螢火蟲熒光素酶基因上游，構建熒光素酶報告質(zhì)粒。再將其與miR-335-5p mimics、miR-NC共轉染至細胞。用裂解液充分裂解細胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書要求操作，加入底物、終止液。結束后，檢測細胞的熒光強度，以海參熒光素酶的發(fā)光強度與螢火蟲熒光素酶發(fā)光強度的比值反映細胞的熒光活性。

2 結果

2.1SNHG8和miR-335-5p 在膀胱移行上皮細胞株和膀胱癌細胞中的表達 結果如表1所示，與SV-HUC-1組相比，SW780、5637、T24、HT-1197細胞中SNHG8表達均顯著升高，miR-335-5p表達均顯著降低(P<0.05)。

表1 SNHG8和miR-335-5p 在膀胱移行上皮細胞株和膀胱癌細胞的表達

2.2沉默SNHG8抑制膀胱癌細胞 SW780增殖和誘導細胞凋亡 結果如表2和圖1所示，與si-con組相比，si-SNHG8組細胞中SNHG8的mRNA表達顯著降低，Ki-67蛋白表達顯著降低，Cleaved caspase-3蛋白表達顯著升高，細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

圖1 沉默SNHG8對膀胱癌細胞 SW780增殖和細胞凋亡的影響

表2 SNHG8抑制膀胱癌細胞 SW780增殖和誘導細胞凋亡

2.3沉默SNHG8抑制膀胱癌細胞 SW780遷移和侵襲 結果如圖2和表3所示，與si-con組相比，si-SNHG8組細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達均顯著降低，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)。

表3 沉默SNHG8抑制膀胱癌細胞 SW780遷移和侵襲

圖2 沉默SNHG8抑制膀胱癌細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達

2.4SNHG8靶向調(diào)控miR-335-5p 的表達 結果如圖3所示，SNHG8與miR-335-5p之間存在靶向結合位點。與miR-con組相比，miR-335-5p組WT-SNHG8細胞熒光活性顯著降低(表4)。與si-con組相比，si-SNHG8組細胞中SNHG8表達顯著升高，與pcDNA組相比，pcDNA-SNHG8組細胞中SNHG8表達顯著降低(表5)(P<0.05)。

表4 雙熒光素酶報告實驗

表5 SNHG8靶向調(diào)控miR-335-5p 表達

圖3 SNHG8與miR-335-5p 存在互補序列

2.5轉染miR-335-5p 抑制膀胱癌細胞 SW780增殖、遷移和侵襲及誘導細胞凋亡 結果如表6和圖4所示，與miR-con組相比，miR-335-5p組細胞中 miR-335-5p表達顯著升高，Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達均顯著降低，Cleaved caspase-3蛋白表達顯著升高，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均顯著降低，細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

圖4 轉染miR-335-5p對膀胱癌細胞凋亡以及增殖、凋亡、遷移相關蛋白表達的影響

表6 轉染miR-335-5p對膀胱癌細胞SW780增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

2.6干擾miR-335-5p 部分逆轉沉默SNHG8對膀胱癌細胞 SW780的抑制作用 結果如表7和圖5所示，與si-SNHG8+anti-miR-con組相比，si-SNHG8+anti-miR-335-5p組細胞中miR-335-5p表達顯著降低，Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達均顯著升高，Cleaved caspase-3蛋白表達顯著降低，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均顯著升高，細胞存活率顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。

表7 轉染anti-miR-335-5p部分逆轉沉默SNHG8對膀胱癌細胞SW780增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

圖5 轉染anti-miR-335-5p部分逆轉沉默SNHG8對膀胱癌細胞SW780凋亡以及增殖、遷移、侵襲和凋亡相關蛋白表達的影響

3 討論

SNHG8在人類的很多癌癥中均作為致癌基因發(fā)揮促進癌癥發(fā)生發(fā)展的作用，但是其在膀胱癌中的研究甚少[8]。ZHEN等[9]在研究中發(fā)現(xiàn)，SNHG8在結直腸癌組織和細胞中顯著上調(diào)，另外，敲低SNHG8能夠明顯抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并且miR-663可與SNHG8相互作用，通過雙重熒光素酶報告基因分析證實了二者之間的靶向關系，此外，回補實驗表明SNHG8通過調(diào)節(jié)miR-663發(fā)揮了促進腫瘤惡化的作用，揭示了SNHG8在結直腸癌中被上調(diào)，并通過靶向miR-663促進結直腸癌的增殖、遷移和侵襲。DONG等[10]在研究中報道，在肝癌組織和細胞中，lncRNA SNHG8的表達水平明顯增加，并且是患者腫瘤復發(fā)的獨立預后因素，此外，SNHG8的敲低抑制細胞增殖、侵襲，而SNHG8的過表達則具有相反的作用，并且SNHG8可作為miR-149的靶標，明顯削弱miR-149在肝癌細胞中的抑癌作用，揭示lncRNA SNHG8可通過靶向抑制miR-149促進肝癌的發(fā)生和轉移。我們在本研究中檢測了膀胱癌細胞中SNHG8的表達，發(fā)現(xiàn)其異常升高，且沉默SNHG8能夠抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲并促進凋亡，這與SNHG8在結直腸癌、肝癌中的作用相一致，說明了SNHG8也具有促進膀胱癌惡化的功能，這是首次發(fā)現(xiàn)該基因在膀胱癌中的功能；進一步通過生物信息學預測、雙熒光素酶報告基因檢測實驗發(fā)現(xiàn)SNHG8可靶向負調(diào)控miR-335-5p，這表明SNHG8在膀胱癌中的功能可能與調(diào)控miR-335-5p有關，也為膀胱癌的精準治療提供了新的作用靶標。這些實驗結果為SNHG8在其他癌癥中的功能開發(fā)提供了新的理論參考。

miRNA在癌癥的進展中具有重要的調(diào)控作用，其可作為上游的Lnc RNA、Circ RNA的靶標，也可與下游的靶基因結合進而干擾靶基因的表達，以發(fā)揮調(diào)控作用[11-12]。有研究報道，miR-335-5p能夠通過靶向絲裂原活化蛋白激酶1、Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶，抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲[13-14]。LIU等[15]發(fā)現(xiàn)，miR-335表達明顯降低，而CT10激酶樣蛋白的調(diào)節(jié)因子(CRKL)表達則明顯升高，CRKL被證實是miR-335在膀胱癌細胞中的特異性靶標，并且CRKL與miR-335表達之間的關系在膀胱癌組織中呈負相關，此外，膀胱癌細胞中的CRKL siRNA基團或miR-335模擬物能夠明顯抑制細胞增殖和遷移，揭示了miR-335可通過上調(diào)CRKL抑制膀胱癌細胞增殖和遷移。YANG等[7]在研究中發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼核糖核酸SLCO4A1-AS1(SLCO4A1-AS1)在膀胱癌中具有促進癌癥進一步惡化的作用，其機制之一為靶向miR-335-5p進而抑制八聚體結合轉錄因子4(OCT4)，可見miR-335-5p在膀胱癌惡化中的重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-335-5p在膀胱癌細胞中的表達異常降低，并且過表達miR-335-5p可抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲并促進凋亡，而抑制miR-335-5p可部分逆轉沉默SNHG8對膀胱癌細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。這些實驗結果與前人的研究結果相一致，說明miR-335-5p為SNHG8的下游靶標之一，為癌癥的治療提供新方向。

綜上所述，長鏈非編碼RNA SNHG8可調(diào)控膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲并促進凋亡，其機制與靶向miR-335-5p有關，為膀胱癌的治療提供參考依據(jù)。