尼莫地平調節PI3K/AKT通路對人結腸癌SW480細胞生長和運動能力的抑制作用①

劉 霄 楊 姝 陳 敏

(遵義醫學院附屬醫院腹部腫瘤科，遵義 563000)

結腸癌是發病率排名前三的胃腸道惡性腫瘤，易發病于40～50歲人群，近年來其發病呈年輕化趨勢[1]。目前，結腸癌的治療以減少復發率和提高生存率為主要目標，主要手段包括手術、化療和放療等綜合治療；近年研究表明，非甾體類抗炎藥可預防消化道腫瘤的產生，與抑制腫瘤細胞生長有關[1-2]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)能活化AKT，參與調控細胞增殖、分化、遷移和凋亡等多種信號傳導。尼莫地平(Nimodipine，Nim，C21H26N207)是第二代1,4-二氫吡啶鈣通道阻滯劑，能通過阻斷非活性構象的L型鈣通道避免鈣離子大量涌入，從而防治血管收縮，具有親脂性，能穿越血腦屏障，因此主要應用于蛛網膜下腔出血后的血管痙攣的治療[3]。此外，研究表明，Nim還具有神經保護作用，在許多耳鼻咽病的治療中發揮作用[4]。有研究表明，PI3K/AKT信號通路與腦血管病變相關的認知功能下降有關，雙側頸總動脈閉塞(2VO)模型大鼠經Nim治療4周后，PI3K/AKT通路相關蛋白明顯上調，腦損傷也顯著減輕[5]。另外，研究發現，PI3K/AKT信號轉導是調控癌癥治療的新途徑，該通路參與了前列腺癌細胞的細胞凋亡、增殖、遷移和侵襲，而Ras抑制劑能通過該通路過抑制SW480細胞的增殖和轉移[6-7]。但Nim能否通過PI3K/AKT通路對結腸癌細胞產生影響還未見報道。因此，本文以體外培養的SW480細胞為研究對象，研究Nim對人結腸癌SW480細胞生長和運動能力的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞來源 人結腸癌細胞株SW480購自北京中科院腫瘤細胞庫。

1.1.2主要試劑 RPMI1640培養液、胎牛血清、0.25%胰酶購自美國賽默飛世爾公司；DMSO購自上海生工；Nim(純度≥98%)、RIPA裂解液購自美國Sigma公司，Nim用DMSO和無血清培養基溶解配制；Transwell小室購自北京優尼康生物技術有限公司；Matrix基質膠購自美國BD公司；BCA試劑盒購自南京碧云天生物科技公司；單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記二抗購自Abcam公司。

1.1.3主要儀器 3111 CO2恒溫培養箱購自美國Thermo Forma公司；TDL-5-A離心機購自中國上海第一醫學院儀器廠；FACS AriaⅡ 流式細胞儀購自美國BD公司；CW-CJ-2F超凈工作臺購自蘇州凈化設備有限公司；電泳儀和半干轉膜儀購自美國伯樂公司；Gel View 6000化學發光凝膠成像系統購自廣州云星儀器有限公司；普通光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基將人結腸癌SW480細胞培養于37℃、5% CO2的恒溫培養箱中。鏡下觀察細胞生長狀態，細胞融合率達80%以上時可傳代。

1.2.2CCK8實驗 將人結腸癌SW480細胞以2×104個/ml接種于96孔板，每孔加入100 μl，待細胞貼壁后，隨機分為4組：Control(對照)組、Nim 10、20和50 μmol/L組，分別給予對應終濃度Nim，每個劑量組設6個復孔；再設置4個亞組，分別在上述操作后繼續培養24、48、72和96 h，之后每孔加入10 μl CCK8溶液，繼續孵育4 h。450 nm吸光度于酶標儀測定各組人結腸癌SW480細胞增殖。

1.2.3流式細胞術 以1×105個/ml將人結腸癌SW480細胞接種于6孔板，待細胞融合率達80%以上時用胰酶收集細胞，調整密度為1×106個/ml。嚴格按照FITC-Annexin V試劑盒說明書，每個樣本加入5 μl的FITC-Annexin V和PI染色液，室溫避光孵育15 min后上機檢測。

1.2.4Transwell實驗 以1×105個/ml將人結腸癌SW480細胞接種于6孔板，待細胞融合率達80%以上時，加入1.2.2所述濃度藥物處理24 h。胰酶收集細胞，調整密度為1×105個/ml，接種于提前用Matrigel基質膠包被好的Transwell小室上層，加入不含胎牛血清的培養液，小室下層加入含胎牛血清的培養液。培養24 h后，無菌拭去Matrigel基質膠和小室上層細胞，PBS洗滌3次，4 %多聚甲醛固定，結晶紫染色細胞，流水沖洗后自然晾干。鏡下隨機選取5個視野計數。實驗至少重復3次，設6個復孔。

1.2.5劃痕實驗 用記號筆在12孔板背面畫出5條平行直線，滅菌備用。以1×105個/ml將人結腸癌SW480細胞接種于滅菌的12孔板。待細胞貼壁后，加入無血清培養基和5 μg/ml絲裂霉素C培養12 h以抑制細胞增殖[8]。再用10 μl槍頭垂直于記號筆橫線劃痕，PBS清洗3次。將細胞隨機分為4組，分別為Control(對照)組、Nim 10、20和50 μmol/L組，給予對應終濃度藥液處理后繼續培養24 h。隨機選取5個視野觀察并拍照。

1.2.6Western blot實驗 用RIPA蛋白裂解液于冰上裂解提取各組細胞總蛋白，4℃離心后取上清用BCA試劑盒進行蛋白定量。蛋白變性后，取等量蛋白進行SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過夜。棄一抗，清洗后加入對應辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h。滴加ECL于暗室曝光顯影，以β-actin為內參。

1.2.7740Y-P對SW480細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的影響 加入PI3K激活劑740Y-P，將SW480細胞隨機分為4組：Control組、Nim50 μmol/L組、740Y-P組和740Y-P+Nim 50 μmol/L組。CCK8法檢測細胞增殖，流式細胞術檢測細胞凋亡，劃痕實驗檢測細胞遷移能力，Transwell檢測細胞侵襲能力，Western blot 檢測Ki67、cl-caspase-3、MMP-2、MMP-9、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達。

2 結果

2.1Nim對體外培養SW480細胞增殖的影響 CCK8法檢測人結腸癌SW480細胞增殖結果顯示，與對照組相比，處理后SW480細胞增殖均明顯降低，組間差異有統計學意義(F=42.04，P<0.001，圖1)，且SW480細胞增殖與Nim處理濃度呈負相關。提示Nim對人結腸癌SW480細胞增殖活性的抑制作用具有劑量依賴性。

圖1 CCK8法檢測人結腸癌SW480細胞增殖

2.2Nim對體外培養SW480細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況結果表明，與對照組相比，隨著Nim給藥濃度增大，10、20和50 μmol/L Nim處理組SW480細胞凋亡率增加(F=85.82，P<0.001，圖2)。提示Nim能劑量依賴性地增加體外培養SW480細胞的凋亡率。

圖2 流式檢測細胞凋亡

2.3Nim對體外培養SW480細胞侵襲能力的影響 Transwell檢測SW480細胞侵襲能力結果顯示，與對照組相比，經Nim處理后各給藥組鏡下觀察侵襲細胞數量明顯減少(F=85.09，P<0.001，圖3)，且Nim濃度越大，侵襲細胞數越少。提示Nim能劑量依賴性地降低SW480細胞的侵襲能力。

圖3 Transwell檢測細胞侵襲能力(×400)

2.4Nim對體外培養SW480細胞遷移能力的影響 劃痕實驗檢測Nim對SW480細胞遷移能力的影響結果顯示，與對照組相比，經Nim處理24 h后各劑量組劃痕愈合率隨Nim濃度增大而明顯降低(F=44.00，P<0.001，圖4)。提示Nim能有效抑制體外培養SW480細胞的轉移能力，且抑制作用與處理濃度呈正相關。

圖4 劃痕實驗檢測細胞遷移能力(×200)

2.5Nim對體外培養SW480細胞生長和運動相關蛋白表達的影響 Western blot檢測SW480細胞生長和運動相關蛋白的表達情況結果如圖5所示，與對照組相比，Nim 10、20和50 μmol/L組細胞Ki67、MMP-2和MMP-9的蛋白表達水平均被抑制，組間差異均具有統計學意義，F值分別為82.54、78.55和72.94，P均<0.001，且這種抑制作用與Nim濃度呈正比；與對照組相比，各劑量組cl-caspase-3的表達水平明顯上調，且與Nim濃度呈正相關，差異有統計學意義(F=62.19,P<0.001)。以上結果表明，在體外培養的SW480細胞中，Nim能劑量依賴性地促進cl-caspase-3表達，抑制Ki67、MMP-2和MMP-9表達，從而抑制SW480的體外生長和運動。

圖5 SW480細胞生長和運動相關蛋白的表達

2.6Nim對體外培養SW480細胞信號通路的影響Western blot檢測SW480細胞信號通路相關蛋白的表達情況結果如圖6所示，與對照組相比，各Nim處理組細胞p-PI3K和p-AKT/AKT蛋白表達水平被明顯抑制，F值分別為61.04和42.92，P均<0.001，且這種抑制作用與Nim濃度呈正比。提示Nim能劑量依賴性地抑制p-PI3K和p-AKT/AKT的蛋白表達，從而影響PI3K/AKT信號通路。

圖6 Western blot檢測SW480細胞信號通路相關蛋白的表達

2.7Nim、740Y-P單用/聯用對SW480細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的影響 用50 μmol/L Nim和PI3K激活劑740Y-P單獨或共處理SW480細胞，檢測細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力，結果表明，與對照組相比，單獨使用Nim或740Y-P可分別顯著降低或增加SW480細胞的增殖(F=10.25，P=0.008)，而兩者共處理時，SW480細胞的增殖較740Y-P單用時也顯著降低(P<0.01)，見圖7A；如圖7B，單獨使用50 μmol/L Nim或740Y-P處理較對照組可顯著增加或降低SW480細胞的凋亡率(F=23.36，P=0.005)，而與單用740Y-P相比，兩者聯合使用可增加細胞凋亡率(F=35.10，P=0.007)；與對照組相比，單用50 μmol/L Nim或740Y-P能顯著抑制或增加侵襲細胞數和劃痕愈合率(F=31.69，P<0.001)，而兩者聯用較單用740Y-P可顯著降低侵襲細胞數和劃痕愈合率(F=56.22，P<0.001，圖7C、D)；與對照組相比，單用Nim處理SW480細胞能抑制Ki67、MMP-2、MMP-9、p-PI3K和p-AKT/AKT蛋白表達，促進cl-caspase-3蛋白表達(F=15.02，P=0.001)，單用740Y-P作用則剛好相反(F=8.69，P=0.006，如圖7E)，但與之相比，兩者聯用可有效逆轉單用740Y-P對上述蛋白表達的影響(F=27.36，P<0.001)。

圖7 Nim與740Y-P共處理對SW480細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力影響

以上結果表明，Nim能有效逆轉PI3K激活劑740Y-P對細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的影響。

3 討論

隨著人們生活水平的提高，飲食結構的改變，結腸癌發病率呈逐年上升趨勢，且越來越年輕化。癌癥的發病機制尚未被完全闡明，主要表現為對抗生長抑制信號、無限增殖、凋亡抵抗、異常代謝(如Warburg效應)等[9]。PI3K/AKT通路的異常激活常與細胞轉化、腫瘤發生、癌癥發展及藥物耐藥性有關，因此臨床上有許多靶向該通路的藥物單獨或聯用于實體瘤和血液惡性腫瘤的治療，如激活PI3K/AKT通路能誘導結腸癌SW480細胞對順鉑的耐藥性[10-11]。研究發現，Nim通過上調PI3K/AKT通路相關蛋白能有效改善2VO模型大鼠的腦損傷和學習記憶能力[5]。因此，本文針對體外培養的人結腸癌SW480細胞研究Nim能否通過PI3K/AKT通路對SW480細胞產生影響。

細胞異常增殖和凋亡抑制是腫瘤發生的重要特點，因此抑制其增殖和促進其凋亡發生是抗癌藥開發的重要思路。體內和體外實驗表明，益智油(高良姜石油醚餾分)通過上調PTEN表達、下調PI3K表達、抑制AKT磷酸化誘導細胞凋亡而對肝癌HepG2、BEL-7402、SMMC-7721和Hep3B細胞的生長呈濃度和時間依賴性抑制[12]。EG-VEGF是一種來自內分泌腺體的血管內皮生長因子，研究發現，EG-VEGF沉默能通過PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制胰腺癌PC細胞增殖，促進細胞凋亡發生[13]。另有研究認為，LINC01133作為一種長鏈非編碼RNA，在多種腫瘤中高表達，敲除LINC01133后能對肝癌HCC細胞增殖產生抑制作用[14]。本文研究發現，Nim處理SW480細胞后，能下調增殖相關蛋白Ki67表達，上調凋亡相關蛋白cl-caspase-3表達，從而抑制SW480細胞增殖，誘導其凋亡。

抑制腫瘤細胞侵襲和轉移是抗癌藥的又一重要靶點。MMPs是一類蛋白水解酶，在腫瘤細胞的侵襲和轉移中發揮重要作用；MMP-2和MMP-9的高表達與多種腫瘤的不良預后有關[15]。研究表明，決明子蒽酮-C-糖苷、決明子苷在結腸癌荷瘤小鼠體內起抗腫瘤和抗轉移作用，其主要機制與抑制VEGF和MMP-9表達及VEGFR-2磷酸化等有關[16]。五味子乙素則能抑制p-AKT、p-mTOR和MMP-9表達，從而劑量依賴性地抑制惡性膠質瘤細胞系U251和U87細胞的遷移和侵襲[17]。Ras抑制劑通過抑制Ras-PI3K-AKT-HIF-1α途徑下調賴氨酰氧化酶而顯示出對人結腸癌細胞SW480的抗轉移作用[7]。RNA螺旋酶DHX33是調節一系列參與細胞周期和細胞遷移的關鍵基因，其敲除可導致體內和體外膠質母細胞瘤細胞增殖和遷移，其產生可被PI3K和mTOR抑制劑誘導[18]。本研究也表明，Nim能有效下調MMP-2和MMP-9蛋白在SW480細胞中的表達，從而抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移。

PI3K隸屬于磷脂激酶家族，機體內多種生長因子均能激活PI3K而產生第二信使PIP3，進而結合活化含有PH結構域的蘇氨酸激酶AKT，參與調控細胞增殖、分化、遷移和凋亡等多種信號傳導。大量研究表明，包括癌癥在內的多種疾病的發生發展都可能與該通路的異常激活相關，如卵巢癌，宮頸癌，肝癌[12,19-21]。研究發現，在慢性阻塞性肺病(COPD)中，缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)高表達通過激活EGFR/PI3K/AKT通路上調炎癥因子表達水平加重COPD的病理改變[22]。研究表明，沉默促凋亡p53蛋白2(apoptosis-stimulating p53 protein 2,ASPP2)后，能通過PI3K/AKT通路影響三陰性乳腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力[23]。另有研究證明，通過調節PI3K/AKT信號通路，長非編碼RNA PlncRNA-1可促進大腸癌細胞的進展，而PlncRNA-1基因敲除可顯著抑制癌細胞的增殖、侵襲和遷移，同時促進其凋亡[24]。苦參堿(oxymatrine,OMT)和/或奧沙利鉑(OXA)處理結腸癌細胞系HT29和SW480結果表明二者均具有抑制結腸癌細胞增殖的作用，且具有協同作用。另外，二者聯用還能通過降低PI3K/AKT/mTOR通路相關蛋白表達誘導結腸癌細胞發生凋亡[25]。本研究也證實，PI3K/AKT信號通路是Nim抑制SW480細胞生長和運動能力的作用機制。

本研究認為，Nim能抑制體外培養的SW480細胞增殖、侵襲和遷移，促進其凋亡，影響凋亡相關分子cl-caspase-3、增殖相關蛋白Ki67、MMP-2、MMP-9及信號通路相關蛋白p-PI3K和p-AKT/AKT的表達水平；還能在單用或與PI3K激活劑740Y-P聯用時表現出對SW480細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的抑制作用。綜上所述，Nim能通過調節PI3K/AKT信號通路實現對人結腸癌SW480細胞生長和運動能力的抑制作用。因此，Nim可能是一種潛在的治療結腸癌的藥物。