天門冬質量及RAPD遺傳多樣性研究

徐昌艷 羅忠圣 曹旭林 錢志瑤 李相陵 覃容貴

摘要?[目的]研究天門冬質量及RAPD遺傳多樣性，并探索其質量與RAPD遺傳多樣性間相關性。[方法]采用綜合評分法，以總皂苷、多糖、浸出物含量為評價指標對天門冬進行質量評價;對天門冬RAPD反應體系進行優化，完成不同居群天門冬RAPD擴增，運用NTSYS?2.10e軟件進行遺傳多樣性分析及UPGMA系統樹圖構建;分析天門冬質量與RAPD遺傳多樣性的相關性。[結果]18份天門冬樣品質量差異較大;18份天門冬多態性百分率為89.62%，遺傳相似系數為0.448?1～0.748?6，在閾值0.52處18份天門冬聚為兩大類，其中貴州遵義桐梓天門冬單獨分為一類，其余聚為一類。[結論]天門冬質量與RAPD遺傳多樣性無顯著相關性，所建立的天門冬RAPD法可用于其遺傳多樣性研究，可為其良種選育、規范化種植奠定基礎。

關鍵詞?天門冬;質量評價;RAPD;遺傳多樣性;UPGMA

中圖分類號?R282.71?文獻標識碼?A?文章編號?0517-6611（2021）03-0180-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.03.048

Abstract?[Objective]The?quality?and?RAPD?genetic?diversity?of?Asparagi?Radix?were?studied，?and?the?correlation?between?the?quality?and?RAPD?genetic?diversity?of?Asparagi?Radix?was?explored.?[Method]The?content?of?the?total?saponins，polysaccharide?and?alcoholsoluble?extract?in?Asparagi?Radix?was?taken?as?the?evaluation?index，?and?the?quality?of?Asparagi?Radix?was?evaluated?by?the?comprehensive?scoring?method.We?optimized?the?RAPD?reaction?system?of?Asparagi?Radix，?and?amplified?different?populations?of?Asparagi?Radix，based?on?the?RAPD?band?data，the?genetic?similarity?coefficients?were?analysed?by?NTSYS?2.10e，and?the?UPGMA?dendrogram?were?developed.The?correlation?between?the?genetic?diversity?of?RAPD?and?the?quality?of?Asparagi?Radix?was?analyzed.?[Result]The?quality?of?18?Asparagi?Radix?samples?was?very?different.The?polymorphism?rate?of?18?Asparagi?Radix?was?89.62%，and?the?genetic?similarity?coefficient?was?0.448?1-0.748?6.In?the?UPGMA?analysis，?under?the?threshold?of?0.52，?18?samples?were?divided?into?two?groups，1?sample?from?Zunyi?County?was?clustered?into?one?group，while?the?rest?of?the?17?samples?were?clustered?into?the?other?group.?[Conclusion]There?is?no?significant?correlation?between?the?quality?and?genetic?diversity?of?Asparagi?Radix.?The?established?RAPD?method?of?Asparagi?Radix?can?be?used?for?the?study?of?its?genetic?diversity，?which?can?lay?the?foundation?for?the?breeding?of?improved?varieties?and?standardized?planting?of?Asparagi?Radix.

Key?words?Asparagi?Radix;Quality?evaluation;RAPD;Genetic?diversity;UPGMA

天門冬（Asparagi?Radix）又名天冬，為《中國藥典》（2015年版）收載品種[1]，不僅直接供中醫臨床配方使用，還作為“口炎清顆粒”“二冬膏”“石斛夜光丸”和“羚羊清肺顆粒”等多種中成藥的主要原料，且天門冬中提取的天門冬甜素被廣泛應用于食品領域。據《中華本草》記載：“貴州、云南、廣西等地為天門冬主產區，其中貴州地區產量最大，品質最好”[2]。貴州地區天門冬主要分布于貴陽、余慶、鳳崗、黔西、大方、息烽、天柱、獨山、荔波、鎮寧、福泉、龍里、榕江、興義、黎平、沿河等地，遵義鳳岡縣有大面積種植[3]。項目組實地調查發現，貴州大方、龍里、息烽、興義、遵義等地有野生天門冬分布，遵義鳳岡縣有栽培天門冬;廣西桂林、玉林、南寧等地有野生天門冬分布，玉林、南寧等地有栽培天門冬;四川內江地區為文獻記載的天門冬種植分布區，但調查發現由于天門冬生長周期長、產地加工方法復雜，該地區已少有農戶種植;同屬植物羊齒天門冬（A.filicinus?Buch.-Ham.ex?D.Don）、密齒天門冬（A.meioclados?Levl.，異名：小莖葉天冬）及西南天門冬（A.munitus?Wang?et?S.C.Chen）的塊根在部分地區被誤作天門冬入藥;且《四川省中藥材標準》收載的小天冬為密齒天門冬，在貴州省稱為“殼天冬”[4]。項目組前期研究發現天門冬質量主要受其總皂苷含量影響，其次與其多糖和醇溶性浸出物相關[5]。

RAPD技術可以利用隨機引物對物種基因組DNA進行多態性檢測，操作簡便、反應迅速、所需DNA量少，被廣泛應用于藥用植物遺傳多樣性研究。物種的遺傳多樣性決定其進化和適應環境的能力，種內遺傳多樣性越高，物種對環境變化的適應能力就越強[6]。因此，該研究收集了貴州、廣西、云南等主產區的18份天門冬樣品，以總皂苷、多糖、醇溶性浸出物含量為指標，采用綜合評分法評價不同產地天門冬質量;優化建立天門冬RAPD的最佳反應體系，對不同產地天門冬進行RAPD遺傳多樣性和親緣關系分析，并進行天門冬質量與RAPD遺傳多樣性的相關性分析，以期為天門冬種質資源篩選和良種選育提供參考。

1?材料與方法

1.1?材料

天門冬樣品均為自采集，經貴州中醫藥大學魏升華教授鑒定為百合科植物天門冬[Asparagus?cochinchinensis（Lour.）Merr.]，樣品剪取幼嫩葉片后再挖取塊根，其中嫩葉片洗凈，吸水紙吸干表面水分，置于封口袋中，于-20?℃低溫保存;塊根洗凈，置恒溫干燥箱50?℃烘干，并粉碎過60目篩，備用。樣品產地詳見表1。

DNAsecure?plan?tkit新型植物基因組提取試劑盒（DP320，北京TIANGEN生化科技有限公司）;瓊脂糖（西班牙）;GoldView?Ⅰ型核酸染色劑、50×TAE緩沖液（北京索萊寶公司）;RAPD隨機引物（上海捷瑞生物工程有限公司）。

1.2?不同產地天門冬質量評價

由于天門冬質量主要與其總皂苷、多糖和醇溶性浸出物含量相關，因此該研究根據前期研究建立的天門冬總皂苷、多糖含量測定方法[5]及《中國藥典》（2015年版）中天門冬浸出物項下醇溶性浸出物含量測定方法進行測定，考慮到總皂苷、多糖、浸出物等成分對天門冬藥材質量的影響程度，分別賦予總皂苷60%、多糖20%、醇溶性浸出物20%的權重，數據處理中引入綜合指標“隸屬度”，采用綜合評分法評價天門冬質量，綜合分=總皂苷隸屬度×60%+多糖隸屬度×20%+浸出物隸屬度×20%，其中指標隸屬度=（指標值-指標最小值）/（指標最大值-指標最小值），滿分為1.00，計算得到綜合評分越高，表示此地天門冬質量越好[7-8]。

1.3?天門冬RAPD遺傳多樣性研究

1.3.1?DNA提取與檢測。

按試劑盒法進行天門冬基因組DNA提取，并采用瓊脂糖凝膠電泳進行天門冬基因組DNA的完整性檢測，然后采用多功能酶標儀進行天門冬基因組DNA濃度及純度檢測。

1.3.2?RAPD反應體系優化。

經文獻查閱及預試驗，確定天門冬RAPD初始反應體系，再對天門冬RAPD-PCR擴增中影響較大的因素（DNA模板濃度、引物濃度、2×Taq?PCR?MasterMix濃度）進行優化，每次改變1個因素時其他條件不變，最終確定天門冬RAPD最優反應體系。擴增程序：95?℃預變性5?min;94?℃變性60?s，再50?℃退火70?s，然后72?℃延伸1.5?min，40次循環;最后72?℃延伸10?min;得到的產物于1.6%瓊脂糖凝膠中進行電泳分離（100?V電壓），1?h后從電泳槽中取出，在凝膠成像系統中進行顯像觀察并記錄拍照[9]。

1.3.3?引物篩選。

分別采用60條RAPD隨機引物（含10個堿基的寡核苷酸）進行天門冬基因組DNA的RAPD擴增，優選出擴增條帶清晰、穩定性好的引物作為天門冬RAPD擴增有效引物。

1.3.4?不同產地天門冬RAPD擴增。

以RAPD優化體系和有效引物分別對18份不同產地天門冬進行PCR擴增，采用人工讀取方式進行條帶統計，并計算條帶多態性百分率（PPB），采用NTSYS?2.10e軟件獲得不同產地天門冬遺傳相似性系數矩陣，并采用非加權配對算術平均法（UPGMA）進行聚類分析，構建不同產地天門冬的親緣關系。

2?結果與分析

2.1?不同產地天門冬質量評價

以天門冬總皂苷、多糖、醇溶性浸出物含量為評價指標，引入“隸屬度”進行綜合評價不同產地天門冬質量，綜合評分見表1。由表1可知，不同產地18份天門冬綜合評分為0.168?4～0.915?0，其中以S9（貴州開陽龍崗鎮2）綜合評分最高，為0.915?0，其次是S13（云南昆明2），綜合評分為0.788?8，S16（貴州省貴安新區黨武鎮）綜合評分最低，為0.168?4。表明18份不同產地天門冬質量差異較大，其中貴州開陽龍崗鎮2產的天門冬質量最好，其次是云南昆明2，而貴州貴安新區黨武鎮產的天門冬質量最差。

2.2?天門冬RAPD遺傳多樣性研究

2.2.1?基因組DNA提取與檢測。

由圖1可見，18份不同產地天門冬的基因組DNA電泳條帶清晰;且天門冬OD260/280值為1.70～1.87，濃度為234.9～253.0?μg/mL，表明提取的天門冬DNA純度高、質量好，可用于后續RAPD擴增。

2.2.2?RAPD反應體系優化。

由圖2可見，根據擴增條帶清晰度、數量、明亮程度對比，選擇條帶清晰、數量多、明亮的條帶，優選出25?μL天門冬RAPD反應體系中DNA模板最適用量應為48?ng，引物最適用量應為1.2?μmol，2×Taq?PCR?MasterMix最適用量應為10.5?μL，ddH2O補足。

2.2.3?引物篩選。

從60條RAPD隨機引物中篩選出的20條有效引物進行RAPD擴增，擴增效果見圖3，20條有效引物共擴增出164條清晰的多態性條帶，其PPB為89.62%，擴增產物的片段大小為100～2?000?bp，平均每條引物擴增出9條條帶，每條有效引物的PPB為77.78%～100.00%，表明天門冬有豐富的多態性。

2.2.4?不同產地天門冬RAPD擴增產物的多態性分析。

18份不同產地天門冬樣品經RAPD擴增出的多態性位點數及PPB結果見表1。其中S5（廣西南寧長崗村）天門冬的PPB?最低，為42.08%，S15（云南昆明4）天門冬的PPB?最高，為68.31%，貴州天門冬的PPB?平均為53.34%，根據多態性百分率就可以看出廣西南寧長崗村的天門冬適應環境的能力稍弱，云南昆明4的天門冬適應環境的能力相對較強。

2.2.5?不同產地天門冬的相似性及聚類分析。

18份不同產地天門冬通過NTSYS?2.10e軟件進行遺傳相似性分析，遺傳相似系數矩陣結果見表2。由表2可知，不同產地天門冬的RAPD遺傳相似系數為0.448?1～0.748?6，說明不同產地天門冬之間存在豐富的遺傳變異。其中S8（貴州開陽龍崗1）樣品與S9（貴州開陽龍崗2）樣品的遺傳相似性系數最大，為0.748?6，表明兩者的親緣關系最近;S11（貴州開陽龍崗4）樣品和S18（貴州遵義桐梓）樣品的遺傳相似性系數最小，為0.448?1，表明兩者的親緣關系最遠。

根據18份不同產地天門冬的遺傳相似系數進行UPGMA系統樹圖構建，結果見圖4。在閾值0.52時，不同產地天門冬聚為兩大類，其中S18單獨分為第Ⅰ類，其余產地天門冬聚為第Ⅱ類，表明貴州遵義桐梓天門冬與其他產地天門冬間的親緣關系較遠，其間存在一定程度的遺傳變異;其中第Ⅱ類在閾值為0.54時又可分為2類，第Ⅰ類包括S1（貴州貴陽新場1）、S4（貴州貴陽新場4）、S5（廣西南寧長崗村）、S7（貴州修文六中）、S8（貴州開陽龍崗1）、S9（貴州開陽龍崗2）、S13（云南昆明2）、S15（云南昆明4）、S16（貴州貴安新區黨武）、S17（貴州關嶺），其余產地為第Ⅱ類。

2.3?天門冬質量與RAPD遺傳多態性的相關性分析

利用SPSS?20.0軟件，采用雙變量相關性法對天門冬質量與RAPD遺傳多樣性多態性百分率（PPB）的相關性進行分析，結果發現（圖5），天門冬總皂苷含量與RAPD遺傳多樣性的相關系數為0.125，對應的顯著性為0.622，在0.05水平上不存在顯著相關性;天門冬多糖含量與RAPD遺傳多樣性的相關系數為0.338，對應的顯著性為0.170，在0.05水平上不存在顯著相關性;天門冬醇溶性浸出物含量與RAPD遺傳多樣性的相關系數為-0.004，對應的顯著性為0.998，在0.05水平上不存在顯著相關性;天門冬質量綜合評分與其RAPD遺傳多樣性的相關系數為0.202，對應的顯著性為0.422，在0.05水平上不存在顯著相關性。因此，初步推斷天門冬質量與RAPD遺傳多態性無顯著相關性，質量好的天門冬對環境的適應能力未必強。

3?討論與結論

由于進行權重的綜合評分法中權重具有主觀隨意性，易導致評價結果的不確定性，因此該試驗以總皂苷、多糖、醇溶性浸出物含量為評價指標，引入綜合指標“隸屬度”，再綜合評分進行18份不同產地天門冬的質量評價，此評價方法更嚴謹，評價結果更可靠[7]。18份不同產地天門冬中，貴州開陽龍崗鎮2產的天門冬評分最高，即質量最好，其次是云南昆明2，而貴州貴安新區黨武鎮產天門冬質量最差，究其原因可能是貴州貴安新區黨武采集地為山坡，土層較薄，具體原因有待進一步研究確定。

高質量的植物基因組DNA是DNA分子標記鑒定的前提，前期研究中分別采用CTAB法和新型植物基因組DNA提取試劑盒法，對天門冬藥材和幼嫩葉片的基因組DNA提取效果進行比較，發現由于天門冬藥材藥用部位為塊根，其組織可能受烘干或日曬、產地加工等影響，使得天門冬藥材基因組DNA提取難度大[10-12]。

該試驗中發現影響天門冬RAPD-PCR擴增的主要因素是模板DNA、引物及Mg2+、Taq?DNA聚合酶和dNTPs濃度，其中模板DNA濃度過低，分子發生碰撞概率小，PCR擴增產物將無或少;而DNA模板的濃度太大，擴增產量過大，條帶數過多，將難以分離，不利于后續條帶讀取;其次引物濃度過低，將直接影響PCR的產率，可能出現無擴增條帶的現象。該試驗所用2×Taq?PCR?MasterMix中包括Mg2+、Taq?DNA聚合酶和dNTPs，其濃度直接影響RAPD穩定性和多態性[13]。因此，該試驗分別考察了模板DNA、引物及2×Taq?PCR?MasterMix的濃度對天門冬RAPD擴增的影響，建立了天門冬RAPD-PCR擴增的最優反應體系。

植物種間或種內個體間遺傳相似系數越大，表明親緣關系越近，遺傳差異越小;遺傳相似系數越小，則親緣關系越遠，遺傳差異越大[13-15]。不同產地18份天門冬的RAPD遺傳相似系數為0.448?1～0.748?6，部分貴州不同產地間的天門冬遺傳相似系數小，其間親緣關系遠，而貴州部分地區與云南昆明的天門冬樣品間遺傳相似系數大，其間親緣關系近;廣西南寧與云南昆明部分天門冬樣品間遺傳相似系數大，其間親緣關系近。并經UPGMA聚類分析，發現S18樣品單獨分為一類，其余樣品聚為一類;在閾值為0.54處時，S1、S4、S5、S7、S8、S9、S13、S15、S16、S17樣品聚為一類，其他7份樣品聚為一類，結果表明，不同居群天門冬之間存在豐富的遺傳多樣性，天門冬對環境的適應能力很強;且遺傳相似系數和聚類分析的結果與樣品來源的地理距離并不存在一致性，可能與樣品來源地的地形、氣候等自然因素有關。

參考文獻

[1]?國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015.

[2]?國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M].上海：上海科學技術出版社，1999.

[3]?曾桂萍，劉紅昌，張先.貴州天門冬適生環境的調查研究[J].貴州農業科學，2010，38（2）：48-50.

[4]?呂向陽，陳艾萌，劉丹，等.內江地區天冬栽培技術與加工工藝現狀與展望[J].現代農業科技，2019（14）：77-79.

[5]?曹旭林，徐昌艷，鄧強，等.商品天冬等級與其活性物質含量的相關性分析[J].中國實驗方劑學雜志，2017，23（22）：55-59.

[6]?申仕康，劉麗娜，王躍華，等.瀕危植物豬血木人工繁殖幼苗的遺傳多樣性及對種群復壯的啟示[J].廣西植物，2012，32（5）：644-649.

[7]?陳會英，周衍平.綜合評分法的改進與應用[J].農業系統科學與綜合研究，1996，12（1）：37-41.

[8]?馮果，曾志乾，吳增光，等.基于綜合評分法的不同產地加工方法對瓜蔞藥材質量的影響[J].安徽農業科學，2017，45（29）：120-123.

[9]?曹旭林.天冬等級劃分的合理性及其遺傳多樣性研究[D].貴陽：貴州醫科大學，2018.

[10]?歐立軍，張人文，談智文，等.我國不同地區天門冬核?DNAITS?序列分析[J].中草藥，2011，42（7）：1402-1406.

[11]?羅焜，馬培，姚輝，等.中藥DNA條形碼鑒定中的DNA提取方法研究[J].世界科學技術（中醫藥現代化），2012，14（2）：1433-1439.

[12]?徐昌艷，雷丹丹，曹旭林，等.天冬藥材基因組DNA提取方法研究[J].安徽農業科學，2019，47（8）：171-173.

[13]?王奕華.青島文昌魚遺傳多樣性的RAPD分析[D].青島：中國海洋大學，2003.

[14]?尹明華，占學林，徐文慧，等.三葉青種質資源遺傳多樣性的隨機擴增多態性DNA分析[J].浙江農業學報，2018，30（11）：1839-1848.

[15]?李相陵，錢志瑤，范菊娣，等.半枝蓮活性物質含量測定及RAPD?遺傳多樣性分析[J].中藥材，2018，41（7）：1571-1576.