不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛種子萌發(fā)和壯苗生根的影響

馬盼 趙萌 王寶玲

摘要?以鐵皮石斛種子為材料，通過組織培養(yǎng)技術(shù)，不添加植物生長調(diào)節(jié)劑直接得到叢生芽，并比較天然有機(jī)物、活性炭等添加物對鐵皮石斛叢生芽壯苗生根的影響，優(yōu)化鐵皮石斛組培快繁技術(shù)體系。結(jié)果顯示，鐵皮石斛種子分化最佳培養(yǎng)基為MS+6 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+80 g/L香蕉泥;芽苗的壯苗生根試驗中，最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+ 0.4 mg/L NAA+ 0.1 mg/L 6-BA+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+80 g/L香蕉泥+0.5 g/L活性炭，有利于芽苗的壯苗和生根。該研究可以一次性直接得到優(yōu)質(zhì)鐵皮石斛幼苗，減少了試驗步驟，節(jié)省人工、降低成本，提高了試驗效率，促進(jìn)原球莖增殖、提高分化率，促進(jìn)壯苗和生根，可為鐵皮石斛快繁和大規(guī)模化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞?鐵皮石斛;培養(yǎng)基;種子萌發(fā);壯苗生根;影響

中圖分類號?S567?文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A?文章編號?0517-6611（2021）01-0154-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.01.041

Abstract?The Dendrobium candidum seeds were used as test materials to get the cluster buds directly without adding the plant growth regulator. The effect of natural organic matter and activated carbon was compared on the adventitious buds proliferation and shoots strengthening and roots induction. The results showed that the best medium for seed differentiation of Dendrobium candidum was MS+6 g/L agar +20 g/L sugar+ 80 g/L banana mud. In the rooting test of strong seedlings， the best medium was 1/2 MS+0.4 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+20 g/L sucrose +6 g/L agar +80 g/L banana mud +0.5 g/L activated carbon， which was beneficial to the strong seedling and rooting. The seedlings of high quality Dendrobium candidum can be obtained directly at one time， which reduce the experimental steps， save labor， reduce the cost， improve the efficiency of the experiment， promote the proliferation of the original bulbs， improve the rate of differentiation， and promote the strong seedling and rooting. It can provide technical support for the rapid and large-scale production of Dendrobium candidum.

Key words?Dendrobium candidum;Medium;Seed germination;Strong seedling rooting;Effect

鐵皮石斛（Dendrobium candidum）又名鐵皮蘭、黑節(jié)草，為蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）植物，全球約有1 500種，主要分布于亞洲的熱帶和太平洋島嶼，既是觀賞植物，又是十分重要的藥用植物，是我國傳統(tǒng)名貴藥材，被列為國家重點保護(hù)藥用植物之一，我國有 76 種，其中可作藥用的約有 40 種，主要分布于我國廣西和南方沿海各省，具有強(qiáng)陰益精、補(bǔ)腎益力、潤肺止咳、明目和延年益壽的功效[1-2]。鐵皮石斛的蒴果中含有幾萬到十幾萬粒種子，鐵皮石斛的種子細(xì)如粉塵，沒有胚乳，在自然條件下較難存活，從而導(dǎo)致鐵皮石斛的自然繁殖率較低，難以獲得實生苗，加上人們?yōu)E采亂挖和生態(tài)環(huán)境破壞，野生鐵皮石斛資源已瀕臨滅絕[3-4]。采用鐵皮石斛的種子進(jìn)行無菌萌發(fā)，并通過組織培養(yǎng)的方法快速大量繁殖瓶苗，是解決鐵皮石斛種苗供不應(yīng)求的有效途徑，是對鐵皮石斛資源進(jìn)行保護(hù)與開發(fā)利用的有效手段[5-7]。

該研究旨在優(yōu)化組培條件，提高鐵皮石斛種子、芽苗增殖率、生長速度及質(zhì)量，為改進(jìn)鐵皮石斛種苗生產(chǎn)技術(shù)措施提供理論和技術(shù)參考。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

鐵皮石斛種子采摘自院內(nèi)連棟溫室，人工授粉后結(jié)成優(yōu)質(zhì)成熟未開裂的蒴果。

1.2?試驗方法

1.2.1?材料消毒。

將鐵皮石斛的蒴果先用洗潔精洗涮，然后用流水沖洗 30 min，在超凈工作臺上，先用75%乙醇浸泡30 s，再用8% 次氯酸鈉浸泡8 min，最后用無菌水沖洗5 次。

1.2.2?種胚萌發(fā)及幼苗分化試驗培養(yǎng)基的篩選。

在超凈工作臺中，將消毒后的蒴果用鑷子夾緊果柄一端，用解剖刀將蒴果另一端切一小口，輕輕抖動，將種子均勻撒在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，立即蓋上瓶蓋，放在培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為2種（CK1、CK2），添加物分別為香蕉泥、芋頭泥、蘋果泥、土豆泥、地瓜泥。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基設(shè)12個處理：①M(fèi)S+6 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+80 g/L香蕉泥，②MS+6 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+80 g/L芋頭泥，③MS+6 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+80 g/L蘋果泥，④MS+6 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+80 g/L土豆泥，⑤MS+6 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+80 g/L地瓜泥，⑥MS+6 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖（CK1），⑦N6+6 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+80 g/L芋頭泥，⑧N6+6 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+80 g/L蘋果泥，⑨N6+6 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+80 g/L土豆泥，⑩N6+6 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+80 g/L香蕉泥，B11N6+6 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+80 g/L地瓜泥，B12N6+6 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖（CK2）;每處理接種20 瓶，重復(fù)3 次，放入培養(yǎng)箱進(jìn)行黑暗培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)溫度 25 ℃，后調(diào)整為光照強(qiáng)度 2 000～3 000 lx，光照時間12 h/d，培養(yǎng)時間18周。統(tǒng)計生長情況。

1.2.3?壯苗生根培養(yǎng)基篩選試驗。

試驗材料為上述剛分化不久的鐵皮石斛幼苗，具有 2～3 片真葉，莖高為 7～15 mm，莖 粗 約 為1 mm，莖節(jié)數(shù)為 2 節(jié)，呈綠色，無根。基礎(chǔ)培養(yǎng)基為3種（CK1、CK2、CK3）。添加物分別為香蕉汁、活性炭。在超凈工作臺上接種叢生芽，每個處理接種10瓶，重復(fù)3次，每瓶接種10個點。培育溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx，光照時間為10 h/d，培養(yǎng)16周。

壯苗培養(yǎng)基設(shè)12個處理：①1/2MS+0.33 g/L（NH4）2SO4+0.525 g/L KNO3+NAA 0.4 mg/L+0.1 mg/L 6-BA+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂（CK1）;②1/2MS+0.33 g/L（NH4）2SO4+0.525 g/L KNO3+NAA 0.4 mg/L+0.1 mg/L 6-BA+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+80 g/L香蕉泥;③1/2MS+0.33 g/L（NH4）2SO4+0.525 g/L KNO3+NAA 0.4 mg/L+0.1 mg/L 6-BA+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+0.5 g/L活性炭;④1/2MS+0.33 g/L（NH4）2SO4+0.525 g/L KNO3+0.4 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+80 g/L香蕉泥+0.5 g/L活性炭;⑤MS+0.4 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂（CK2）;⑥MS+0.4 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+80 g/L香蕉泥;⑦M(jìn)S+0.4 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+0.5 g/L活性炭;⑧MS+0.4 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+80 g/L香蕉泥+0.5 g/L活性炭;⑨1/2MS+0.4 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂（CK3）;⑩1/2MS+0.4 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+80 g/L香蕉泥;B111/2MS+0.4 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+0.5 g/L活性炭;B121/2MS+0.4 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+80 g/L香蕉泥+0.5 g/L活性炭。

2?結(jié)果與分析

2.1?種胚萌發(fā)及幼苗分化試驗培養(yǎng)基的篩選

近年的研究中，鐵皮石斛組織培養(yǎng)中，用種子作為外植體培養(yǎng)組培苗時，一般經(jīng)過誘導(dǎo)、增殖、分化、壯苗、生根這幾個步驟[8-9]。為了達(dá)到簡化鐵皮石解組織培養(yǎng)步驟、縮短培養(yǎng)時間及為快速育苗和工廠化生產(chǎn)提供便利的目的，該研究采用不添加植物生長調(diào)節(jié)劑直接得到叢生芽的研究方法。

由表1和圖1可知，不同培養(yǎng)基上鐵皮石斛種胚萌發(fā)、幼苗分化情況不同[10]。在12個處理的培養(yǎng)基中，不添加天然有機(jī)物的處理CK1、CK2，種子萌發(fā)情況不佳。MS加香蕉泥的配方（處理①），種子萌發(fā)情況最好，原球莖顏色深綠，萌發(fā)度高，且基本分化成鐵皮石斛幼苗，顯著優(yōu)于其他配方。較好的是MS加土豆泥（處理④）、MS加地瓜泥（處理⑤）、N6加芋頭泥（處理⑦）以及N6加土豆泥（處理⑨）。N6加香蕉泥（處理⑩）萌發(fā)度高，但是顏色發(fā)黃，效果不好。由此可知，MS中加入一定濃度的香蕉泥，有利于促進(jìn)種子萌發(fā)，使萌發(fā)時間、數(shù)量、分化狀況、生長狀況均達(dá)到較理想的水平（圖1）。這種培養(yǎng)基可以一次性直接得到優(yōu)質(zhì)鐵皮石斛幼苗，減少了試驗步驟，提高了試驗效率。

2.2?壯苗生根培養(yǎng)基篩選試驗

由表2和圖2可知，不同培養(yǎng)基上鐵皮石斛壯苗生根情況不同。在12個處理的培養(yǎng)基中，不添加天然有機(jī)物的處理CK1、CK2、CK3，幼苗生長情況不佳。基礎(chǔ)配方一致的情況下，添加活性炭的配方（處理③、⑦、B11）普遍比添加香蕉泥的配方（處理②、⑥、⑩）表現(xiàn)好，添加活性炭可以有效地防治鐵皮石斛幼苗褐化現(xiàn)象，顯著促進(jìn)根系生長。既添加活性炭又添加香蕉泥的配方（處理④、⑧、B12）表現(xiàn)最好，根長、根數(shù)、莖高、莖粗、葉片數(shù)均有顯著提高。在12種配方中，1/2MS+0.4 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+80 g/L香蕉泥+0.5 g/L活性炭的配方（處理B12）表現(xiàn)最好，鐵皮石斛苗長得粗壯高大，葉片數(shù)多，根多，根長。

3?結(jié)論

通過大量的培養(yǎng)基篩選試驗，MS培養(yǎng)基比N6培養(yǎng)基得到叢生芽的效果要好。MS培養(yǎng)基中加入一定濃度的香蕉泥，有利于促進(jìn)種子萌發(fā)，使萌發(fā)時間、數(shù)量、分化狀況、生長狀況均達(dá)到較理想的水平。這種培養(yǎng)基可以一次性直接得到優(yōu)質(zhì)鐵皮石斛幼苗，減少了試驗步驟，提高了試驗效率。鐵皮石斛壯苗生根試驗中，1/2MS+0.4 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+80 g/L香蕉泥+0.5 g/L活性炭的配方表現(xiàn)最好，鐵皮石斛苗長得粗壯高大，葉片數(shù)多，根多，根長。

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