超高效液相色譜-三重四級桿質譜同時檢測苦蕎中10種真菌毒素

唐振濤 于剛 劉菲 俞凌云 薛康

摘要?[目的]建立QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測苦蕎樣品中10種真菌毒素。[方法]苦蕎樣品經水和乙腈提取后，采用QuEChERS方法凈化。通過超高效液相色譜-三重四級桿質譜在多反應監測模式（MRM）下進行目標真菌毒素的分析。試驗對樣品前處理、儀器分析條件進行優化;考察方法的基質效應、檢出限、精密度、回收率等參數。[結果]根據基質效應考察結果，50%的目標真菌毒素具有顯著的信號抑制/增強效應。為了補償基質效應的影響，選用基質配標法進行目標真菌毒素的分析。方法的線性范圍為0.5～50.0 μg/L（對于黃曲霉毒素B2、G2，線性范圍為0.125～12.500 μg/L），檢出限和定量限分別低至0.011和0.040 μg/L，回收率為89.70%～105.83%，RSD<9%（n=6）。[結論]建立的方法簡便、可靠，具有較好的靈敏度和準確性，能有效用于苦蕎樣品中多組分真菌毒素的檢測。

關鍵詞?苦蕎;多組分真菌毒素;QuEChERS;超高效液相色譜-三重四級桿質譜

中圖分類號?TS211.7?文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2021）01-0188-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.01.051

Abstract?[Objective]To establish an analysis method for simultaneous determination of 10 mycotoxins in buckwheat samples based on QuEChERS-ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.[Method]As a typical run，mycotoxins were extracted with water and acetonitrile，followed by purification with QuEChERS procedure.The target mycotoxins were analyzed by UPLC-MS/MS in multiple reaction monitoring （MRM） mode.The sample pretreatment and instrumental analysis method were respectively optimized.Finally，matrix effect，detection limits，precision and accuracy were investigated.[Result]According to the investigation of matrix effect，50% of the target mycotoxins have encountered prominent signal suppression / enhancement.To compensate the significant matrix effect，matrix-matched calibration curves were finally employed in this study.The linear range of targets were 0.5-50.0 μg/L （0.125-12.500 μg/L for AFB2，AFG2）.Detection limits （LOD） and quantification limits （LOQ） were respectively detected down to 0.011 and 0.040 μg/L.Recoveries were obtained ranging from 89.70% to 105.83% with RSD< 9%.[Conclusion]The established method exhibits several advantages of simplicity，reliability，good sensitivity and accuracy.It is feasible and effective to apply this method for determination of multi-mycotoxins in buckwheat samples.

Key words?Buckwheat;Multi-mycotoxins;QuEChERS;UPLC-MS/MS

苦蕎是蓼科蕎麥屬植物，在我國西南、中南、華北等地均有分布。該類植物能適應環境惡劣的生長環境，主要作為糧食和飼料供人們使用。苦蕎含有優于小麥、玉米等的蛋白質及氨基酸，還含有大量維生素和多種礦質元素，具有豐富的營養價值[1]。另一方面，苦蕎富含黃酮類、甾體類、多糖等生物活性成分;藥理學研究表明苦蕎具有降血壓、降血脂、降血糖、抗氧化、預防心血管疾病等作用[2-4]。隨著苦蕎藥理作用的研究發現，“藥食同源”的苦蕎及其產品迎來廣闊的市場前景，有關苦蕎產品的開發利用也得到越來越多的關注[5]。然而，與其他谷物一樣，苦蕎面臨著易被真菌毒素污染的難題[6]。真菌毒素污染不僅會對人體健康造成巨大危害，還將嚴重影響苦蕎及其制品的經濟效益[7]。目前有關苦蕎中真菌毒素的研究還比較少，尤其是多組分真菌毒素的同時檢測[6]。

食品中真菌毒素的檢測方法有很多，包括高效液相色譜法、薄層色譜法、色譜質譜聯用法、酶聯免疫法等[8-9]。其中，液相色譜-串聯質譜法是最常用的檢測方法[10-12]。該方法可以實現多目標物的同時檢測，靈敏度高，能提供化合物的結構信息，具有更高的可靠性。作為復雜基質中多組分真菌毒素的關鍵步驟，簡單、高效、低成本的樣品前處理方法能進一步提高分析的準確性和實用性[13]。QuEChERS法因其簡便、有效、溶劑用量少被廣泛用于食品中農藥殘留的提取凈化[14]。近年來，已逐漸被用于食品中真菌毒素的前處理并取得一定進展[10，15]。由于苦蕎基質復雜，而真菌毒素常以痕量存在，該研究選擇結合QuEChERS法和超高效液相色譜-串聯質譜，建立了簡便、有效的分析方法，有利于實現苦蕎樣品中多組分真菌毒素的同時檢測。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

10種真菌毒素標準品：黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，玉米赤霉烯酮，伏馬毒素B2，T-2毒素，HT-2毒素，赭曲霉毒素A，柄曲霉素，純度95.0%～98.9%，奧地利Biopure公司;甲醇、乙腈，HPLC級，美國Fisher Scientific公司;甲酸、乙酸銨，MS級，德國Sigma公司;無水硫酸鎂、氯化鈉，分析純，成都科隆化學品有限公司;尼龍針式濾頭（0.22 μm），天津津騰實驗設備有限公司;凈化材料（PSA、GCB、C18、Al2O3），上海安譜實驗科技股份有限公司;氧化石墨烯，自制。

1.2?儀器與設備?超高效液相色譜-三重四級桿質譜（Acquity Xevo TQ-XS，美國Waters公司）;C18色譜柱（50 mm×2.1 mm×2.7 μm，美國Waters公司）;電子分析天平（XS205DU，梅特勒-托利多儀器有限公司）;渦旋混合器（XW-80A，上海滬西分析儀器有限公司）;純水機（Milli-Q integral 3，美國MILLIPORE公司）;離心機（3K30，德國Sigma公司）;高速粉碎機（德國IKA公司）。

1.3?樣品前處理

1.3.1?樣品制備。由成都海關技術中心理化實驗室隨機提供15個苦蕎樣品。樣品用高速粉碎機粉碎，過篩;混合均勻后縮分至500 g，密封保存于4 ℃以下，供檢測用。

1.3.2?樣品提取。取2 g（精確至0.01 g）樣品粉末于50 mL離心管中，加入10 mL去離子水將其浸沒。然后加入10 mL乙腈，渦旋混勻，搖床振蕩30 min。提取后以10 000 r/min的速度離心，將上清液轉移到干凈的離心管中。快速加入2 g無水MgSO4和1 g NaCl，并渦旋3 min。再次離心，取上清液備用。

1.3.3?樣品凈化。準確移取2 mL提取液，加入30 mg C18，渦旋1 min后離心。將1 mL上清液在40 ℃下用氮氣緩慢吹至近干，加入1 mL初始流動相，繼續渦旋1 min。最后用0.22 μm濾膜過濾待測液，收集至進樣瓶，備用。

1.4?儀器分析條件

1.4.1?色譜條件。流動相：0.1%甲酸水+5 mmol/L乙酸銨（A相），0.1%甲酸甲醇+5 mmol/L乙酸銨（B相）;柱溫：40 ℃;進樣量：2 μL;梯度洗脫程序見表1。

1.4.2?質譜條件。

質譜配備電噴霧離子源（150 ℃，正離子模式ESI+）;檢測方式：多反應監測模式（MRM）;錐孔氣流速：150 L/h;脫溶劑氣溫度及流速：250 ℃，800 L/h;目標化合物物的采集參數（包括離子對、碰撞電壓、錐孔電壓）見表2。

2?結果與分析

2.1?提取溶劑的優化

由于去離子水能促進真菌毒素從樣品基質釋放出來，真菌毒素的提取過程中首先加入10 mL去離子水浸泡樣品。在此基礎上，3種提取溶劑被用于樣品基質中10種真菌毒素的提取，包括①10 mL去離子水，10 mL甲醇;②10 mL去離子水，10 mL乙腈;③10 mL去離子水，10 mL 1%甲酸乙腈。試驗結果表明，甲醇有機相不能通過加入無機鹽與水相分離。另一方面，第3種提取溶劑會導致伏馬毒素B2的回收率異常高。而采用第2種提取溶劑時，真菌毒素的萃取效率和回收率均能得到較為滿意的結果。因此，最終選擇10 mL去離子水、10 mL乙腈為提取溶劑。

2.2?凈化材料的優化

為了降低共提取化合物的干擾，試驗測試了多種類型的凈化材料，包括N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化炭黑（GCB）、磁性氧化石墨烯（MGO）、C18和Al2O3。為了比較不同材料的凈化能力，進行了6組平行試驗，包括未凈化的提取溶液。由表3可見，對于PSA材料，伏馬毒素B2沒有回收率，這可能是因為PSA含有氨基官能團，能與含羧基基團的化合物發生化學吸附。相似地，與未凈化的提取溶液相比，含有羧基基團的赭曲霉毒素A的回收率也較低。對于吸附能力較強的GCB，柄曲霉素和HT-2毒素的回收率有所降低，而黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的回收率更低。對于MGO，伏馬毒素B2同樣沒有回收率，這可能是由材料的氫鍵吸附造成。另一方面，比較MGO和未凈化提取溶液的試驗結果發現，兩者具有相似的目標物回收率。說明MGO對苦蕎樣品中干擾物的凈化能力比較有限。Al2O3的堿性性質造成伏馬毒素B2沒有回收率，而赭曲霉毒素A的回收率有所降低。相比之下，通過C18凈化的目標物的回收率有所改善（75.18%～127.32%），它能降低樣品基質的干擾，同時不對目標物產生不必要的吸附。因此，最終選擇C18作為凈化材料。

2.3?基質效應的考察

通過基質配標校準曲線的斜率與溶劑配標校準曲線的斜率百分比值定義方法的基質效應（信號增強或抑制，SSE），結果見表4。該比值代表了干擾物對目標分析物離子化效率的影響。從表4可以看出，黃曲霉毒素G1、G2，T-2毒素，赭曲霉毒素A的基質效應尚在可接受范圍（80%～120%）。黃曲霉毒素B2和伏馬毒素B2則具有顯著的信號增強效應（SSE值>100%），而其他4種真菌毒素（黃曲霉毒素B1、柄曲霉毒、玉米赤霉烯酮、HT-2毒素）具有25%～40%的信號抑制效應（SSE值<100%）。

根據考察結果，50%的目標真菌毒素具有顯著的基質效應。為了補償基質效應的影響，選用基質配標法進行目標分析物的定量分析。基質匹配目標分析物的MRM色譜圖如圖1所示。

2.4?線性關系、檢出限和定量限的考察

采用不含真菌毒素的苦蕎樣品，按建立的樣品預處理方法制備空白基質溶液。通過在空白基質液中加入相應量的真菌毒素混合標準品，配制基質匹配的系列標準溶液（0.5～50.0 μg/L，對于黃曲霉毒素B2、G2，濃度范圍為0.125～12.500 μg/L）。以目標化合物的色譜峰峰面積為縱坐標、溶液濃度為橫坐標，進行線性回歸分析。方法的回歸方程、決定系數、線性范圍見表5。方法的檢出限（3倍信噪比）及定量限（10倍信噪比）通過線性方程中最低濃度點計算得到。

由表5可見，決定系數（R2）均不小于0.994 0，表明校正曲線在0.125～50.000 μg/L具有較好的線性關系。10種真菌毒素的檢出限（0.011～0.241 μg/L）及定量限（0.040～0.804 μg/L）表明方法具有較好的定性和定量分析能力。從另一方面來看，黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的檢測能力均能滿足多個國家對谷物中這3類真菌毒素的監管要求（表6）。而其他7種真菌毒素目前暫無谷物的限量規定。

2.5?回收率和重現性試驗

在12份空白樣品中分別加入一定量的混合標準溶液，得到2個濃度級別的6份平行加標樣（2和10 μg/L，對于黃曲霉毒素B2、G2，濃度分別為0.5和2.5 μg/L）。按上述方法制備樣品并進行檢測，計算各真菌毒素的平均回收率和相對標準偏差（RSD）。結果表明（表7），平均回收率為89.70%～105.83%，RSD值為0.82%～8.45%，符合歐盟No 401/2006條例對真菌毒素定量分析的性能標準（回收率在70%～110%，RSD<15%）。

2.6?實際樣品的檢測

將建立的方法用于15個隨機樣品的檢測分析。對于實際樣品分析，采用相對離子豐度作為額外的定性分析準則。樣品的檢測結果見表8。

從檢測結果（表8和圖2）可以看出，46.7%的樣品存在真菌毒素污染。雖然大部分毒素的污染濃度都低于方法的定量限，污染通常伴隨多種類型的真菌毒素。對于13號樣品，黃曲霉毒素B1的濃度超過了歐盟的監管限量。而其他被檢測到的柄曲霉素、伏馬毒素B2、T-2毒素、HT-2毒素暫沒有針對谷物的限量規定。

3?討論

該研究成功建立了苦蕎基質中10種不同真菌毒素的QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜分析方法。該方法簡單可靠、靈敏有效，適合大批量樣品的高通量分析。從實際苦蕎樣品的分析得到以下結論：①該方法用于苦蕎樣品中多種真菌毒素的檢測分析是切實可行的;②應探究更多種類的真菌毒素的同時檢測方法;③由于真菌毒素污染通常伴隨多種類型的真菌毒素，多組分真菌毒素的污染監管是很有必要的。

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