QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法檢測中藥砂仁中10種氨基甲酸酯類農藥殘留

張振山 樂淵 黎舒懷 劉春華 李萍萍

摘要?[目的]建立QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜檢測砂仁中10種氨基甲酸酯類農藥殘留量的方法。[方法]砂仁樣品先用含1%甲酸的乙腈溶液提取，再經鹽析劑鹽析后加入MgSO4、PSA和C18進行萃取、凈化，采用UPLC-MS/MS檢測，基質匹配標準曲線外標法進行定量。[結果]目標化合物在2.5～100.0 μg/L有良好的線性關系，R2≥0.999;在0.02、0.08和0.40 mg/kg 3個添加水平下，10種農藥成分加標回收率為70.7% ～ 113.3%，RSD為0.2%～4.9%（n=3）;定量限（LQD）在0.19～4.01 μg/kg。[結論]該方法操作簡單、凈化效果好、靈敏度高、準確度高，適用于砂仁藥材中10種氨基甲酸酯類農藥的殘留檢測。

關鍵詞?砂仁;氨基甲酸酯類農藥;QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜

中圖分類號?S481+.8?文獻標識碼?A?文章編號?0517-6611（2021）01-0199-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.01.053

Abstract?[Objective]To establish a method for the simultaneous determination of 10 carbamate pesticide residues in Amomum villosum Lour. by QuEChERS-ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. [Method]The samples were extracted with acetonitrile （containing 0.1% formic acid）and followed by salting-out process， the extract was further purified by C18， PSA and anhydrous magnesium sulfate. The prepared samples were then analyzed by UPLC-MS/MS and quantified by the matrix-matched standard calibration curve method. [Result]The target compound had a good linear relationship between 2.5-100.0 μg/L， R2≥0.999;at spiked levels of 0.02，0.08 and 0.40 mg/kg， the average recoveries of all the pesticides were 70.7% - 113.3%， and the RSD was 0.2% -4.9%（n =3） . The limits of detection（LOD） was 0.19 - 4.01 μg/kg. [Conclusion]The method has simple operation， good purification effect， high sensitivity and high accuracy， and is suitable for the detection of 10 carbamate pesticide residues in Amomum vilosum Lour..

Key words?Amomum villosum Lour.;Carbamate pesticide;QuEChERS-UPLC-MS/MS

砂仁是姜科植物陽春砂（Amomum villosum Lour.）、綠殼砂（Amomum villosum Lour.var.xanthioides T.L.Wu et Senjen）或海南砂（Amomum longiligularg T.L.wu）的干燥成熟果實，為四大南藥之一，具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎的功效，主要用于濕濁中阻、脘痞不饑、脾胃虛寒、嘔吐泄瀉、妊娠惡阻、胎動不安等病癥[1]，在治療消化系統等方面的疾病具有很獨特的功效[2]。隨著砂仁藥材的需要量逐年增加，砂仁的人工種植面積也在逐漸擴大，藥材的農藥濫用誤用現象也時有發生[3]。

氨基甲酸酯類農藥是在有機磷類農藥之后發展起來的一種合成農藥，作為殺蟲劑、除草劑和殺菌劑廣泛應用于農業生產中，具有高效、低殘留的特點[4]。然而，在中藥材的害蟲防治過程中也易產生農藥殘留，不僅會污染水體、土壤，破壞生態結構，也會影響臨床用藥健康，對人類的健康產生危害[5]。筆者擬采用 QuEChERS 凈化工藝，優化提取與凈化方法，旨在建立砂仁中10種氨基甲酸酯類農藥殘留的檢測方法，滿足砂仁中氨基甲酸酯類農藥的日常檢測要求。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?儀器設備。

TE412-L電子天平（德國賽多利斯公司）;XW-80A微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器有限公司）;MS 3 basic 型振蕩器（德國 IKA 公司）;VS-24SMT高速大容量離心機（美國VISION公司）;Triple Quad 4500液相色譜三重四極桿串聯質譜儀（美國SCIEX公司）。

1.1.2?試劑。

甲醇、乙腈、甲酸（色譜級，美國Fisher公司）;氯化鈉、醋酸銨、無水硫酸鎂均為國產分析純，購自國藥集團化學試劑北京有限公司;乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅膠鍵合相（C18）購于美國 Agilent 公司;超純水以美國Millipore公司Milli-Q超純水系統制備獲得;0.22 μm微孔濾膜購自安譜實驗科技（上海）股份有限公司。

標準物質：抗蚜威、異丙威、霜霉威、克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、甲萘威、滅多威（1 000 μg/mL，農藥標準品購自天津農業部環境質量監督檢驗測試中心）。

1.1.3?試材。

試驗所用16批砂仁樣品來自于廣東、云南、廣西、海南的藥材基地和藥材市場，經海南省樂東黎族自治縣熱作辦公室陳祥軍老師鑒定，均為姜科豆蔻屬植物砂仁的果實。樣品經粉碎機粉碎后，過3號篩（藥典篩，50目），裝于密封袋中，置干燥器中保存、備用。

1.2?方法

1.2.1?樣品的前處理。

1.2.1.1?提取。準確稱取5.00 g試樣，置于100 mL離心管中，加入4 g氯化鈉和2 g無水硫酸鈉，再加入20.0 mL乙腈（含1%甲酸），浸泡15 min，3 000 r/min渦旋振動1 min，再以5 000 r/min離心5 min。

1.2.1.2?凈化。取上層溶液5.0 mL于預先加有1 000 mg MgSO4、200 mg PSA及200 mg C18的離心管中，渦旋混勻1 min，再以5 000 r/min離心5 min 。吸取上清液1.0 mL與1.0 mL甲醇水溶液（50%）1∶1混合均勻，過0.22 μm微孔濾膜，經UPLC-MS/MS上機分析。

1.2.2?標準溶液的配制。

1.2.2.1?標準儲備溶液。取10種氨基甲酸酯類標準物質，分別精密吸取1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成100 mg/L的各農藥標準儲備液，-18 ℃保存。

1.2.2.2?混合標準溶液。精密吸取0.1 mL上述標準儲備溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1.00 mg/L的混合標準溶液，-18 ℃保存。

1.2.2.3?混合標準工作液。分別精密吸取1.00 mg/L的混合標準溶液0.05、0.10 、0.20 、0.40 、1.00和2.00 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇水溶液（50%）定容，配制成0.005、0.010、0.020、0.040、0.100和0.200 μg/mL的系列濃度的標準工作液。

1.2.2.4?基質混合標準工作液。準確稱取5.00 g空白砂仁樣品各5份，按“1.2.1”的方法進行前處理試驗，吸取上清液和混合標準工作液按體積比1∶1混合均勻，配制成0.002 5、0.005 0、0.010 0、0.020 0、0.050 0和0.100 0 μg/mL的基質混合標準工作液。

1.2.3?儀器工作條件。

1.2.3.1?色譜條件。

色譜柱為ACQUITY UPLCTM BEH C18（2.1 mm×50 mm），1.7 μm ，柱溫35 ℃，進樣量5 μL。流動相A為1.0 mmol/L乙酸銨溶液（pH=4.5），流動相B為甲醇，流速為0.25 μg/min。梯度洗脫程序，0～1.0 min，90% A;1.0～2.0 min，90%～30% A;2.5～4.0 min，30%A;4.0～5.0 min，30%～5% A;5.0～9.0 min，5% A;9.0～9.1 min，5%～90% A;9.1～10.0 min，90% A。流速0.25 μg/min。

1.2.3.2?質譜條件。

離子源：ESI源，正離子模式;離子源溫度：550 ℃;毛細管電壓：5.5 kV;霧化氣壓力：344.7 kPa;去溶劑氣壓力：413.7 kPa;氣簾氣壓力：72.4 kPa;碰撞氣壓力：55.2 kPa;檢測模式：多反應監測（MRM）模式。MRM模式下10種農藥的質譜參數見表1。

2?結果與分析

2.1?UPLC-MS/MS分析參數的優化

在ESI源正離子模式下，以10種氨基甲酸酯類農藥的單標溶液作為調試液進行手動調諧，優化各化合物的母離子和子離子，每個化合物選取2組靈敏度較高的離子對作為定量離子和定性離子，并獲得最佳的錐孔電壓和碰撞能量等參數，結果見表1。

取0.02 μg/mL的混合標準工作溶液，經UPLC-MS/MS上機，獲得10種氨基甲酸酯類農藥成分的總離子流色譜圖（圖1）和MRM色譜圖（圖2），在10 min內，可完成上述農藥的分析，對應的保留時間見表1。

2.2?方法學驗證

2.2.1?線性關系考察。取“1.2.2.4”中的基質混合標準工

作溶液，經UPLC-MS/MS分析，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，結果表明，10種氨基甲酸酯類農藥在2.5～100.0 μg/L線性關系良好，R2≥0.999（表2）。稱取空白砂仁樣品，加入標準溶液進行樣品添加試驗，按照“1.2.1”方法進行前處理試驗并上機，以3倍信噪比（S/N）計算砂仁中10種農藥的檢出限，各農藥的方法檢出限在0.06～1.20 μg/kg（表2），根據10倍信噪比計算理論定量限在0.19～4.01 μg/kg。

2.2.2?精密度試驗。

取“1.2.2.4”中的基質混合標準工作溶液，按“1.2.3”儀器工作條件，連續進樣6針，記錄色譜圖峰面積，結果發現，抗蚜威、異丙威、霜霉威、克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、甲萘威和滅多威峰面積的RSD值分別為0.5%、0.2%、0.5%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%，表明儀器精密度良好。

2.2.3?穩定性試驗。

取“1.2.2.4”中的基質混合標準工作溶液，按“1.2.3”儀器工作條件，分別于0、2、4、8、12、18、24 h進樣，記錄色譜圖峰面積，結果發現，抗蚜威、異丙威、霜霉威、克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、甲萘威和滅多威峰面積的RSD值分別為4.4%、2.7%、2.6%、7.7%、7.2%、4.7%、5.9%、2.2%、1.7%、7.1%，表明供試品溶液24 h內穩定性良好。

2.2.4?重復性試驗。

稱取編號1的藥材6份，按照“1.2.1”提取方法，以0.40 mg/kg作為添加濃度，做加樣回收率試驗，記錄色譜圖峰面積，結果發現，抗蚜威、異丙威、霜霉威、克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、甲萘威和滅多威峰面積的RSD值分別為0.5%、0.2%、0.5%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%，表明該方法重復性良好。

2.2.5?加樣回收率試驗。

選取0.02、0.08和0.40 mg/kg作為加樣回收試驗的3個添加濃度，取編號1的藥材，按照“1.2.1”方法，計算10種農藥回收率，每個水平平行測定3次，平均回收率和相對標準偏差RSD見表3。結果表明，10種農藥殘留的平均回收率為70.7%～113.3%;RSD為0.2%～4.9%，均滿足定量分析要求。

2.3?樣品測定

按照“1.2.1”樣品前處理方法和“1.2.3”儀器分析條件，對采集的16批砂仁樣品進行檢測，每份樣品平行測定2次，結果發現并未在樣品中檢測出10種氨基甲酸酯類農藥的存在。

3?結論與討論

3.1?提取方法的優化

砂仁作為常用的芳香化濕類中藥，含有豐富的揮發性成分，如乙酰龍腦酯、樟腦、龍腦、月桂烯等，同時也含有多糖、脂肪酸、色素、鞣質等成分[6]，對砂仁的農藥殘留測定具有一定的干擾，不僅降低了儀器的靈敏度和準確度，還增加了儀器的維護成本。因此，在對樣品檢測前，需要對樣品進行一定的凈化處理。

QuEChERS是近年來應用于食品檢測中十分普遍的一項前處理技術，具有快速、便捷、分析范圍廣、準確率高的特點[7]。該試驗采用1%甲酸的乙腈溶液提取砂仁樣品，再加入了PSA、C18作為吸附劑對提取液進行凈化，以PSA吸附其中的有機酸、鞣質等極性成分，以C18去除其中的一些非極性成分，可以得到顏色較淺、無色澄清的待測溶液。

3.2?基質效應

基質效應（matrix effect，ME）是影響定量準確度的關鍵因素之一，會對目標化合物的準確定量造成較大影響。ME的評價方法常以基質標準曲線的斜率與溶劑標準曲線的斜率之比來進行評估，當ME值在80%～120%為無明顯基質效應，在80%以下為基質抑制效應，在120%以上為基質增強效應[8]。

為提高分析方法的可靠性，試驗對砂仁提取液的基質效應也進行了考察。配制砂仁基質匹配標準溶液和純溶劑標準溶液進行儀器分析，繪制校正曲線，計算兩者斜率之比，結果發現均小于80%，其中異丙威、3-羥基克百威和滅多威的斜率比分別為13.0%、19.4%、17.2%，說明均存在不同程度的基質抑制效應現象，因此，該試驗采用砂仁基質匹配標準溶液進行定量分析。結果表明，10種農藥在2.5～100.0 μg/L線性關系良好，R2≥0.999;在0.02、0.08和0.40 mg/kg 3個添加水平進行回收試驗，10種農藥回收率在70.7%～113.3%。

3.3?色譜條件的選擇

目前測定食品中氨基甲酸酯的分析方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質譜法、液相色譜-質譜法以及生物檢測法和生物傳感器法[9]。由于氨基甲酸酯類化合物極性強、熱穩定性差，目前以液相色譜-柱后衍生法和液相色譜-質譜法較為普遍[10]。液相色譜-柱后衍生法需要經柱分離后在線水解生成甲胺，再進行熒光衍生，定性手段比較單一，抗干擾能力弱，對于砂仁中農藥的檢測存在一定量的不足[11]。在中國藥典2015版中，也有部分氨基甲酸酯類農藥采用液相色譜-串聯質譜法進行測定。該研究采用超高效液相色譜-串聯質譜法檢測砂仁，方法簡便快捷、靈敏度高、基質效應小、準確度高，適用于砂仁中氨基甲酸酯類農藥的檢測。

3.4?樣品測定

砂仁在國內的產地主要有廣東、廣西、云南、海南四省，隨著臨床使用量的擴大，野生資源逐漸減少，開始轉為人工種植，其中以云南、廣東產量較高，尤以云南省栽培面積最廣[12]。但由于中藥種植的基礎設施較薄弱，規模化的中藥種植易受到病蟲害的影響，農藥濫用亂用的現象時有發生[13-14]。該研究采集的16批藥材中，經檢測，并未有抗蚜威等10種氨基甲酸酯類農藥的檢出，通過回訪，推測其原因為農戶一般在砂仁的苗期對葉片進行農藥噴施，果期施用較少。但建立砂仁中氨基甲酸酯類農藥的QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，為砂仁中氨基甲酸酯類農藥的防控監測提供了一項重要的技術手段，也可以為姜科同屬的其他作物和藥材的檢測提供技術依據。

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